蔣建宏，周菊峰，胡鈔粟，肖碧源，肖圣雄，李強國

（1.湘南稀貴金屬化合物及其應用湖南省重點實驗室，湖南，郴州　423043；2.湘南學院化學與生命科學系，湖南，郴州　423043）

槲皮素鑭配合物對S.Pombe細胞生長代謝熱動力學的影響

蔣建宏1，2，周菊峰2，胡鈔粟2，肖碧源2，肖圣雄1，2，*李強國1，2

（1.湘南稀貴金屬化合物及其應用湖南省重點實驗室，湖南，郴州423043；2.湘南學院化學與生命科學系，湖南，郴州423043）

采用八通道微量熱法探討槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝熱動力學的影響。測定在槲皮素鑭配合物作用下S.Pombe細胞的生長代謝產熱曲線，并研究其生長速率常數（k）、最大發(fā)熱功率（pmax）、達最大發(fā)熱功率時間（tmax）和抑制率（I）等熱動力學參數。微量熱結果表明：隨著槲皮素鑭配合物濃度c的增大，最大發(fā)熱功率pmax和速率常數k減小；達最大發(fā)熱功率時間tmax和抑制率I增大。研究表明槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝產生了抑制作用。

槲皮素鑭配合物；微量熱法；粟酒裂殖酵母細胞

稀土金屬具有抗炎、殺菌、鎮(zhèn)痛、治燒傷等生物活性［1］，稀土配合物的合成主要是將具有特定生物活性的配體與稀土離子配合，以達到具有更好的生物活性的目的。研究表明：當金屬元素與活性有機配體反應形成配合物后，其配合物往往具有一些新的獨特的生理生化功能，因而稀土配合物在生命過程中起著十分重要的作用［2］，因此，研究稀土配合物的生物活性具有重要意義。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，化學名為3，3’，4’，5，7- 五羥基黃酮。槲皮素不僅在自然界中廣泛分布，其藥理作用也很廣泛，它不僅具有抗氧化及清除自由基的作用，還具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降壓、免疫調節(jié)及心血管保護等作用［3］。同時槲皮素分子具有較高的超離域度，完整的大π鍵共軛體系，含有多個配位基團，其中的氧原子具有強配位能力，其空間結構也利于配合物的形成［4］，所以槲皮素可作為稀土金屬離子的良好螯合配體。利用槲皮素特殊的藥理作用以及與金屬離子之間的協(xié)同效應，可使合成的新配合物不僅具有更高的清除超氧陰離子自由基能力、提高抗腫瘤活性，同時還可降低毒副作用。鑭是稀土元素之一，與槲皮素配位形成的配合物，可改善槲皮素的生物活性［5］。這對尋找新型、高效、低毒的活性配合物具有指導價值。

粟酒裂殖酵母細胞是一個良好的表達高等真核生物基因的系統(tǒng)，在某些方面粟酒裂殖酵母細胞與高等動物有一定的相似性［6］，許多有關人體細胞的研究成果都是首先通過研究酵母細胞發(fā)現的。當細胞生長代謝過程受到藥物作用時，其代謝產熱功率發(fā)生改變，而TAM air八通道生物活性檢測系統(tǒng)可以準確的檢測到生物代謝過程所產生的熱量。通過微量熱法所測得的代謝熱量，可以了解藥物對細胞生長代謝的作用。因此，以粟酒裂殖酵母細胞作為實驗材料，探討槲皮素稀土鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞生長的影響，可為槲皮素稀土鑭配合物的活性研究提供理論基礎，具有較好的研究價值。

1　實驗部分

1.1實驗儀器與試劑

1.1.1儀器

尼高力Avatar360傅里葉紅外光譜儀；S7-401型定時電動攪拌器（山東華魯電熱儀器有限公司）；鼓風干燥箱（北京朝陽區(qū)來廣營醫(yī)療器械廠）；3116-2/3239 TAM Air 八通道熱導式等溫微量熱儀（瑞典Thermometric AB 公司）；WL-160A- CO2細胞培養(yǎng)箱（上海峰宇生物科技有限公司）。

1.1.2 試劑

槲皮素（國藥集團化學試劑有限公司）；無水氯化鑭（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（沈陽化學試劑廠，分析純）；其他試劑均為分析純；實驗用水為三重蒸餾水。

1.1.3 菌種

粟酒裂殖酵母細胞（Schizosaccharomyces pombe，S.Pombe）微生物研究所菌種保存中心。YES培養(yǎng)基：酵母粉5.000 g；葡萄糖30.000 g；亮氨酸0.225 g；腺嘌呤0.225 g；賴氨酸0.225 g；尿嘧啶0.225 g；組氨酸0.225 g；三重蒸餾水1000 mL。振搖使其充分混勻后，分裝于4個已滅菌干燥的250 mL錐形瓶中，用牛皮紙包好，于121 ℃下滅菌備用。

1.2實驗方法

1.2.1槲皮素鑭配合物的合成

槲皮素鑭配合物是由筆者依據有關文獻［7］將槲皮素與無水氯化鑭反應人工合成。將0.3 mmol槲皮素用一定量無水乙醇熱溶解，待完全溶解后，加入裝有回流裝置三頸瓶中，在80 ℃水浴中加熱攪拌，以乙醇鈉調節(jié)pH至9.0，再加入0.1 mmol氯化鑭的乙醇溶液，加熱回流，使其反應5 h，冷卻，放置過夜，抽濾、洗滌、干燥，得棕黃色固體。經紅外光譜分析，合成的槲皮素鑭配合物［LaL3·6H2O， L=槲皮素］與文獻相同。

1.2.2槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞的影響

槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞的抑制生長作用由微量熱法測定［8］。準備8個已滅菌干燥的安培瓶，每個安培瓶中精密加入5 mL培養(yǎng)液，每個安培瓶按實驗要求加入一定量的槲皮素鑭配合物溶液，然后再加入10 μL培養(yǎng)好的粟酒裂殖酵母細胞，編號，壓蓋密封。將編號的安培瓶依次放入八通道微量熱儀中，進行數據采集，連續(xù)記錄粟酒裂殖酵母細胞生長代謝熱功率曲線。

1.3實驗結果

1.3.1粟酒裂殖酵母的生長產熱曲線

在32 ℃條件下，粟酒裂殖酵母細胞正常生長熱譜曲線如圖1所示。由圖可知，粟酒裂殖酵母細胞隨著槲皮素鑭配合物濃度的增加，最大產熱功率逐漸降低，說明槲皮素鑭配合物使粟酒裂殖酵母細胞生長產生了變化。

圖1　在不同濃度槲皮素鑭配合物作用下粟酒裂殖酵母細胞的產熱曲線Fig.1　Power-time curves for the growth of S.Pombe affected by C15H10O6·La

1.3.2 粟酒裂殖酵母細胞生長期熱動力學參數的計算

從生長代謝的產熱曲線可以看出，粟酒裂殖酵母細胞的生長包括停滯期、指數生長期、穩(wěn)定期和衰減期等階段。在細菌生長的指數生長期［9］內細菌的數量按指數規(guī)律增長，其數學表達式為

式中：t為指數生長期開始后的某一時間，t0為生長期開始的時間，pt是粟酒裂殖酵母細胞在t時刻的熱輸出功率，k是粟酒裂殖酵母細胞在指定條件下的生長速率常數（見表1）。

為了便于討論，定義藥物對細菌生長代謝過程的抑制率為

式中k0為細菌未受到藥物作用時生長代謝的速率常數，kc為細菌受到濃度為c的藥物作用時的速率常數。根據以上定義，我們計算了粟酒裂殖酵母細胞在不同濃度的藥物作用下的抑制率I（見表1）。

表1　在32 ℃時裂殖酵母細胞在不同濃度的槲皮素鑭配合物作用下生長期的熱動力學參數Table 1　Thermokinetic parameters of the growth of S.Pombe affected by different concentrations of C15H10O6·La at 32℃

1.3.3 生長速率常數k與藥物濃度c的關系

由槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞影響的熱譜圖，可計算出在不同濃度槲皮素鑭配合物作用下，粟酒裂殖酵母細胞的生長速率常數k。以粟酒裂殖酵母細胞的生長速率k對配合物濃度c進行Logistic 曲線擬合（圖2），得以下方程：

圖2　粟酒裂殖酵母細胞生長代謝速率常數k與配合物濃度c的關系Fig.2　Rate constants of growth of S.Pombe with concentration of C15H10O6·La

由表1和圖2可得出，在實驗濃度范圍內，逐量增加槲皮素鑭配合物濃度，粟酒裂殖酵母細胞生長速率常數k逐漸變小。說明在該實驗濃度范圍內，槲皮素鑭配合物不同程度的抑制了粟酒裂殖酵母細胞生長代謝，且隨著槲皮素鑭配合物濃度的增加，對粟酒裂殖酵母細胞生長代謝的抑制作用也越明顯。

1.3.4最大發(fā)熱功率Pmax與濃度c的關系

粟酒裂殖酵母細胞的最大發(fā)熱功率Pmax與濃度c的關系如圖3所示。由表1和圖3可得出，在實驗濃度范圍內，隨著槲皮素鑭配合物濃度的不斷增加，粟酒裂殖酵母細胞最大發(fā)熱功率Pmax逐漸變小。說明槲皮素鑭配合物影響了粟酒裂殖酵母細胞的生長代謝，導致發(fā)熱功率Pmax的改變。以Pmax與濃度c進行Logistic曲線擬合（圖3），得方程如下：

圖3　粟酒裂殖酵母細胞生長代謝最大熱功率pmax與配合物濃度c的關系Fig.3　The max heating power of S.Pombe with concentration of C15H10O6·La

1.3.5達最大功率時間tmax與濃度c的關系

粟酒裂殖酵母細胞達最大功率時間tmax與濃度c的關系如圖4所示。由表1和圖4可得出，在實驗濃度范圍內，隨著槲皮素鑭配合物濃度的遞增，粟酒裂殖酵母細胞達到最大功率的時間逐漸增長。說明槲皮素鑭配合物濃度越大，對粟酒裂殖酵母細胞的抑制作用越明顯。以達最大功率時間 tmax與濃度c進行Logistic曲線擬合（圖4），得方程如下：

圖4　達最大功率時間tmax與配合物濃度c的關系Fig.4　tmaxof the max heating power of S.Pombe with concentration of C15H10O6·La

1.3.6抑制率I與濃度c的關系

粟酒裂殖酵母細胞生長期的抑制率I與濃度c的關系如圖5所示。由表1和圖5可見，在實驗濃度范圍內，隨著配合物濃度的不斷增加，抑制率I逐漸增大。說明配合物對粟酒裂殖酵母細胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強。以抑制率I與濃度c進行Logistic曲線擬合（圖5），得方程如下：

圖5　粟酒裂殖酵母細胞生長代謝抑制率I與配合物濃度c的關系Fig.5　Inhibitive ration of S.Pombe with concentration of C15H10O6·La

2　結論

微量熱法測定結果表明：槲皮素和氯化鑭單獨使用時對粟酒裂殖酵母細胞作用的效果不明顯，但槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞作用相對較強，且在實驗濃度范圍（0.00～3.99 mg·mL-1）內，隨著配合物濃度的增加，槲皮素鑭配合物對粟酒裂殖酵母細胞生長產生的抑制作用增強，其作用機理還有待今后進一步研究。

［1］ 張金超，楊夢蘇.稀土配合物藥物研究進展［J］.稀有金屬，2005，29（6）:919-926.

［2］ 陳愛美，施慶珊，歐陽友生.稀土抗菌效應及應用的研究進展［J］.微生物學通報，2009，36（1）:90-96.

［3］ 唐麗君，陳翔，仇佩虹.黃酮類金屬配合物的研究進展［J］.廣東微量元素科學，2008，15（12）:6-13.

［4］ 渠文濤，朱瑋，翟廣玉，等.槲皮素衍生物的合成及生物活性研究進展［J］.化學研究，2012，23（4）:101-110.

［5］ 王俊杰，赫春香.槲皮素-鍺配合物的合成及清除氧自由基活性的研究［J］.高師理科學刊，2010，30（1）:71-74.

［6］ 岳強，周惠，粟酒裂殖酵母——一種良好的真核模式生物（II） ［J］.韶關學院學報，2003，3（24）:99-102.

［7］ 董樹國，王曉麗，槲皮素-鑭配合物的合成與光譜表征［J］.吉林醫(yī)藥學院學報，2010，31（1）:11-13.

［8］ 曹慧，李東亮，于游，等.雙（三環(huán)己基錫）丁二酸酯的合成、晶體結構和抑菌性質［J］.井岡山大學學報:自然科學版，2012，33（4）:30-33.

［9］ 肖圣雄，李強國，李旭，等.鐠配合物的熱化學及其對酵母菌作用的熱動力學研究［J］.中國科學:化學，2010: 1422-1429.

THERMODYNAMIC EFFECT OF THE QUERCETIN LANTHANUM
COMPLEXES ON PROLIFERATION OF SCHIZOSACCAROMYCES POMBE CELLS

JIANG Jian-hong1，2， ZHOU Ju-feng2， HU Chao-su2， XIAO Bi-yuan2， XIAO Sheng-xiong1，2，*LI Qiang-guo1，2
（1.Hunan Provincial Key Laboratory of Xiangnan Rare-Precious Metals Compounds Research and Application， Chenzhou， Hunan 423043， China；
2.Department of Chemistry and Life Sciences， Xiangnan University， Chenzhou， Hunan 423043， China）

To study the thermodynamic effect of the quercetin lanthanum complexes on proliferation of Schizosaccharomyces pombe cells， eight channels microcalorimetry was performed to determine the heat production curve of cell proliferation and metabolism after the quercetin lanthanum complexes was added， and thermodynamic parameters such as growth and metabolism rate constant （k）， the maximum heating power （pmax），the max heating power time （tmax） and inhibition rate （I） were also investigated.The microcalorimetric results showed that the maximum heating power pmaxand rate constant k decreased but the max heating power time tmaxand inhibition rate I enlarged with the increasement of concentration c of quercetin lanthanum complexes.It could be concluded that quercetin lanthanum complexes inhibited the cell growth and metabolism of S.pombe.

quercetin lanthanum complexes； microcalorimetry； Schizosaccharomyces pombe cell

O642/R962

ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2015.02.006

1674-8085（2015）02-0020-05

2014-11-20；修改日期：2015-02-16

國家自然科學基金項目（21273190）；湖南省科技計劃項目（2013FJ3033；2012TP4021-6；2010FJ3053）；湘南學院科研基金項目（2013YJ36； 2014XJ52）；湘南學院大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（校發(fā)［2013］15號）；湘南學院大學生科研課題項目（校發(fā)［2014］10號）

蔣建宏（1984-），男，湖南邵陽人，助教，碩士，主要從事生物熱化學研究（E-mail:jiangjianhong927@163.com）；

周菊峰（1963-），男，湖南邵陽人，副教授，主要從事生物熱化學研究（E-mail: hnsd333@126.com）；

胡鈔粟（1991-），女，湖南益陽人，湘南學院化學與生命科學系應用化學專業(yè)2011級本科生（E-mail:huchaosu@163.com）；

肖碧源（1994-），女，湖南邵陽人，湘南學院化學與生命科學系應用化學專業(yè)2012級本科生（E-mail:1586769784@qq.com）；

肖圣雄（1975-），男，湖南郴州人，副教授，碩士，主要從事熱化學研究（ E-mail:54xsx@163.com）；

*李強國（1963-），男，湖南郴州人，二級教授，主要從事生物熱化學研究（ E-mail:liqiangguo@163.com）.