尹秋蓉，童 娟，羅 穎，王勝朝，胡 軼

（陜西西安710032：1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室）

機(jī)械損傷對(duì)小鼠切牙成釉器細(xì)胞Notch表達(dá)的影響

尹秋蓉1，童 娟1，羅 穎2，王勝朝1，胡 軼1

（陜西西安710032：1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室）

目的：研究機(jī)械損傷后小鼠切牙成釉器細(xì)胞中Notch信號(hào)的表達(dá)及變化。方法：通過磨除小鼠下頜切牙牙冠的1/2部分建立小鼠下頜切牙的機(jī)械損傷模型，并將其隨機(jī)分為損傷后3、5、7d組，同時(shí)以不做切牙磨除處理的小鼠作為正常對(duì)照；用免疫組織化學(xué)染色方法觀察各組成釉器細(xì)胞中Notch1、Notch2的表達(dá)變化情況。結(jié)果：對(duì)照組中，Notch1、Notch2僅在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中微弱表達(dá)；損傷后3d組，Notch1、Notch2在成釉細(xì)胞和中間層細(xì)胞均呈密集的陽性表達(dá)，在星網(wǎng)狀層細(xì)胞有散在陽性表達(dá)；損傷后5d組，Notch1、Notch2在成釉細(xì)胞、中間層、星網(wǎng)狀層細(xì)胞仍呈明顯的陽性表達(dá)；損傷后7d組，Notch1、Notch2在各層細(xì)胞中的表達(dá)均較損傷后3、5d組有所減弱。結(jié)論：機(jī)械損傷可激活小鼠切牙成釉器細(xì)胞中Notch信號(hào)的表達(dá)，從而參與調(diào)控切牙的損傷修復(fù)。

Notch信號(hào)；成釉器細(xì)胞；切牙；機(jī)械損傷

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2015，25（4）：193］

小鼠切牙具有一生不斷生長的特性，這種再生功能的維持依賴于其頸環(huán)干細(xì)胞的存在。進(jìn)化保守的Notch信號(hào)具有維持干細(xì)胞生存和調(diào)控其增殖、分化的作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠切牙頸環(huán)有Notch受體的表達(dá)［1］；當(dāng)小鼠切牙頸環(huán)的Notch信號(hào)被抑制后，頸環(huán)的生長也受到明顯抑制，星網(wǎng)狀層細(xì)胞凋亡明顯增加，從而導(dǎo)致星網(wǎng)狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示Notch信號(hào)是小鼠切牙頸環(huán)上皮干細(xì)胞生存所必需的［2］。此外，在成釉細(xì)胞終末分化區(qū)，同樣有Notch受體（Notch1、Notch2、Notch3）及其配體Serrate1的表達(dá)［1］，提示Notch信號(hào)可能對(duì)成釉器不斷形成牙釉質(zhì)以維持小鼠切牙不斷萌出的功能特性具有十分重要的作用。但是，Notch信號(hào)在小鼠切牙的損傷修復(fù)中是否也起作用，目前尚無相關(guān)研究資料證明。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠切牙機(jī)械損傷模型，用免疫組化染色觀察損傷修復(fù)中小鼠切牙成釉器細(xì)胞Notch信號(hào)的表達(dá)變化，并討論其意義。

1　材料和方法

1.1主要材料和儀器

昆明小鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Notch1、Notch2兔抗鼠多克隆抗體（071232、071233，Merck Millipore，德國）；SP、DAB試劑盒（北京中杉金橋）；普通光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2方法

1.2.1小鼠切牙損傷模型的制備

取健康成年雌性昆明小鼠20只（體質(zhì)量25～30 g），經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉并仰臥固定后，利用隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組（n=5）。其中3個(gè)實(shí)驗(yàn)組用牙科高速手機(jī)和金剛砂車針磨除各小鼠下頜切牙的冠部1/2牙體組織后，分別置于常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)3、5、7d；對(duì)照組各小鼠切牙不做任何處理，置于實(shí)驗(yàn)組相同環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2.2取材和組織切片制備

上述建模結(jié)束后，用40 g/L多聚甲醛液心內(nèi)灌注處死各組小鼠，立即分離其下頜骨并于切牙區(qū)取材。分別將各標(biāo)本浸泡于新鮮配制的40 g/L多聚甲醛液內(nèi)，4℃下固定48 h后，100 g/L EDTA 4℃下脫鈣4周；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，沿標(biāo)本近遠(yuǎn)中向作4 μm厚的連續(xù)切片。

1.2.3免疫組化染色檢測(cè)Notch1、Notch2的表達(dá)情況

各組石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后，用30 mL/L過氧化氫室溫下作用10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS清洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min；傾去血清，不洗，分別滴加Notch1、Notch2兔抗鼠多克隆抗體（以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照），置于濕盒中4℃過夜。次日37℃復(fù)溫1 h，PBS清洗5 min×3次，滴加生物素化的二抗工作液，37℃孵育40 min；PBS清洗5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min；PBS清洗5 min×3次，用DAB顯色試劑盒顯色（顯微鏡下控制顯色程度）；PBS終止顯色后，ddH2O反復(fù)沖洗，蘇木精輕度襯染5 s；溫水沖洗返藍(lán)、鹽酸分化1～2 s、10 g/L氨水還原3 s后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。Notch1、Notch2染色陽性結(jié)果以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)，并以顏色深淺為判定標(biāo)準(zhǔn)：無黃色為陰性表達(dá)；淺黃色為弱陽性表達(dá)；棕黃色為陽性表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1Notch1在各組成釉器細(xì)胞中的表達(dá)

對(duì)照組（圖1a、e）：Notch1在成釉細(xì)胞中不表達(dá)，僅在中間層細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈微弱表達(dá)；損傷后3d組（圖1b、f）：Notch1在成釉細(xì)胞和中間層細(xì)胞中均呈明顯的陽性表達(dá)，在星網(wǎng)狀層細(xì)胞中亦有散在的陽性表達(dá)；損傷后5d組（圖1c、g）：Notch1在成釉細(xì)胞、中間層細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞中仍呈陽性表達(dá)；損傷后7d組（圖1d、h）：Notch1在成釉細(xì)胞、中間層細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞中的表達(dá)均較損傷后3、5d組有所減弱。

圖1　Notch1在各組成釉器細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2Notch2在各組成釉器細(xì)胞中的表達(dá)

Notch2在各組中的表達(dá)呈現(xiàn)出與Notch1類似的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)照組（圖2a、e）：Notch2在成釉細(xì)胞中不表達(dá)，僅在中間層細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈微弱表達(dá)；損傷后3d組（圖2b、f）：Notch2在成釉細(xì)胞、中間層細(xì)胞及與其鄰近的星網(wǎng)狀層細(xì)胞中均呈密集的陽性表達(dá)，在稍遠(yuǎn)處的星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈散在陽性表達(dá)；損傷后5d組（圖2c、g）：Notch2在成釉細(xì)胞、中間層細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中仍呈陽性表達(dá)；損傷后7d組（圖2d、h）：Notch2在各層細(xì)胞中的表達(dá)均較損傷后3、5d組有所減弱。

圖2　Notch2在各組成釉器細(xì)胞中的表達(dá)情況

3　討論

成熟組織的再生依賴于干細(xì)胞的存在。小鼠的切牙之所以能在其一生中不斷地萌出，就是由于其牙根頂部存在具有增殖和分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞，其中上皮干細(xì)胞分別位于唇、舌側(cè)頸環(huán)處，而間充質(zhì)干細(xì)胞則位于二者之間。舌側(cè)頸環(huán)較小，不能分化形成成釉細(xì)胞，因而不能形成牙釉質(zhì)。唇側(cè)頸環(huán)較大，由位于中央的星網(wǎng)狀層細(xì)胞和中間層細(xì)胞以及周圍的內(nèi)、外釉上皮細(xì)胞組成［3］；其中的上皮干細(xì)胞位于星網(wǎng)狀細(xì)胞層并能不斷地向內(nèi)釉上皮層遷移并形成短暫增殖的細(xì)胞；后者可逐步向前成釉細(xì)胞、分泌前的成釉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最后形成分泌期成釉細(xì)胞并沿著切牙唇面由根部向牙尖頂部移動(dòng)；然后再通過分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)并礦化形成牙釉質(zhì)［4-5］。小鼠切牙上皮干細(xì)胞的生存、增殖和分化過程受上皮、間充質(zhì)相互作用的調(diào)控，這當(dāng)中牽涉許多促進(jìn)和抑制信號(hào)間的微妙平衡。例如，F(xiàn)GF、BMP4、Activin和BCL11B信號(hào)均參與調(diào)控上皮干細(xì)胞的增殖和分化，并進(jìn)而調(diào)控切牙的大小和唇舌側(cè)的不對(duì)稱度；而Sprouty、Follistatin則對(duì)以上信號(hào)通路具有反向抑制作用，也參與調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)的形成［3，6-9］。

有研究表明，Notch信號(hào)具有調(diào)控多種組織干細(xì)胞和祖細(xì)胞（如骨髓、腸上皮和各種神經(jīng)組織等）的生存、增殖、分化作用［2］。牙齒發(fā)育過程涉及多種Notch受體和配體的表達(dá)，其中Notch1、Notch2表達(dá)于星網(wǎng)狀層細(xì)胞［1，10］；并認(rèn)為Notch信號(hào)通路具有決定小鼠切牙頸環(huán)星網(wǎng)狀層細(xì)胞命運(yùn)的作用［2，11-12］。有研究發(fā)現(xiàn)，從頸環(huán)上皮干細(xì)胞增殖分化進(jìn)入成釉細(xì)胞終末分化區(qū)域的星網(wǎng)狀層細(xì)胞、中間層細(xì)胞和成釉細(xì)胞中也有Notch信號(hào)的表達(dá)［1］。為進(jìn)一步研究Notch信號(hào)在成年小鼠唇側(cè)成釉器中的表達(dá)及意義，本實(shí)驗(yàn)通過制備成年小鼠切牙機(jī)械損傷模型，并觀察其切牙唇側(cè)成釉器細(xì)胞中Notch信號(hào)的表達(dá)變化，進(jìn)而探討Notch信號(hào)在小鼠切牙損傷修復(fù)中的作用。

本實(shí)驗(yàn)選取唇側(cè)處于分泌期的成釉器進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Notch受體Notch1、Notch2在正常小鼠切牙的成釉細(xì)胞中不表達(dá)，僅在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈微弱表達(dá)，與Harada等［1］的報(bào)道基本一致。Harada等發(fā)現(xiàn)，在成釉細(xì)胞終末分化區(qū)域，Notch1表達(dá)于中間層細(xì)胞，Notch2主要表達(dá)于星網(wǎng)狀層細(xì)胞，Serrate1密集表達(dá)于終末分化的成釉細(xì)胞；提示，Notch信號(hào)具有維持成釉細(xì)胞終末分化狀態(tài)的作用。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械損傷后3d和5d時(shí)，Notch1、Notch2不僅在成釉細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，兩者在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中的表達(dá)也有所增強(qiáng)，其中以Notch2的表達(dá)增強(qiáng)更明顯。在損傷后7d時(shí)，Notch1、Notch2的表達(dá)均逐漸減弱，表現(xiàn)為：在成釉細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)或不表達(dá)，在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)。以上結(jié)果說明，機(jī)械損傷可引起小鼠切牙成釉器細(xì)胞中Notch信號(hào)的表達(dá)增強(qiáng)并呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，表現(xiàn)為先上升（在損傷后3～5d表達(dá)較強(qiáng)），然后逐漸下降（在7d時(shí)趨向恢復(fù)到損傷前水平）的趨勢(shì)；并且在終末分化的成釉細(xì)胞中也出現(xiàn)了Notch受體的表達(dá)。

小鼠切牙不同于磨牙和人類切牙，其牙釉質(zhì)只在唇側(cè)形成，而舌側(cè)無牙釉質(zhì)覆蓋；這種結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性使得小鼠切牙極易被磨耗，從而在一生不斷萌出的情況下依然能維持在一個(gè)固定的長度［6］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，將小鼠下頜切牙牙冠截?cái)嘀?，其生長速度會(huì)加快，并在1個(gè)月內(nèi)恢復(fù)到原有長度［13］。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，損傷后小鼠切牙大概以每天0.5 mm的速度生長，并且在損傷后7d時(shí)，其暴露于口腔的牙冠長度基本達(dá)到未磨除前的長度。小鼠切牙的再生與唇側(cè)釉質(zhì)的不斷新生密切相關(guān)，釉質(zhì)的形成又依賴于頸環(huán)上皮干細(xì)胞的不斷增殖分化從而形成成釉細(xì)胞。研究表明，成年干細(xì)胞的分裂增殖周期常相對(duì)較長且慢，它們?cè)诿鎸?duì)特異性的環(huán)境刺激信號(hào)時(shí)能夠做出反應(yīng)，或產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或進(jìn)入特異性的分化程序。當(dāng)新生組織被損傷破壞時(shí)，干細(xì)胞呈現(xiàn)出活躍的分化狀態(tài)，子代細(xì)胞進(jìn)一步增殖分化出大量的干細(xì)胞以補(bǔ)充損失，進(jìn)而加快組織的損傷修復(fù)［14-15］。由此看來，損傷導(dǎo)致切牙的生長速度加快，并在損傷后7d就能基本恢復(fù)到原有長度；說明損傷后切牙頸環(huán)的干細(xì)胞可能處于活躍的增殖分化狀態(tài)，從而使新生成釉細(xì)胞的速度加快，數(shù)量增加，進(jìn)而加速釉質(zhì)的形成，促進(jìn)損傷修復(fù)。同時(shí)，損傷導(dǎo)致成釉器中的成釉細(xì)胞、中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中Notch信號(hào)的表達(dá)先上調(diào)后下降，并且在7d時(shí)趨向恢復(fù)到正常水平，而此時(shí)的切牙也基本恢復(fù)到正常長度，二者之間存在一定的同步性。預(yù)計(jì)，當(dāng)牙齒的損傷修復(fù)完成時(shí)，Notch信號(hào)的表達(dá)也將恢復(fù)到正常水平。因此我們推測(cè)，在牙齒損傷修復(fù)的過程中，成釉器中Notch信號(hào)的表達(dá)上調(diào)可能參與成釉器細(xì)胞功能的調(diào)控，進(jìn)而可能與加快成釉細(xì)胞分泌牙釉質(zhì)基質(zhì)，促進(jìn)損傷修復(fù)有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，成年小鼠切牙成釉器中Notch信號(hào)的表達(dá)對(duì)于維持其不斷生長的能力至關(guān)重要，而機(jī)械損傷后成釉器中Notch信號(hào)的激活和表達(dá)上調(diào)可能對(duì)于調(diào)控成釉器細(xì)胞的功能、進(jìn)而促進(jìn)釉質(zhì)基質(zhì)分泌，加快損傷修復(fù)具有重要作用。Notch信號(hào)表達(dá)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化從分子水平上體現(xiàn)了損傷修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程，Notch信號(hào)對(duì)小鼠切牙的損傷修復(fù)可能具有調(diào)節(jié)作用。

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Effect of mechanical injury on the expression of Notch signaling in enamel organ cells of mouse incisor

YIN Qiu-rong*，TONG Juan，LUO Ying，WANG Sheng-chao，HU Yi
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Preventivedentistry School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

AIM：To investigate the expression and role of Notch signaling in enamel organ of mouse incisor after mechanical injury.METHODS：The animal model of mechanical injury was established by grinding off 1/2 crown of mouse mandibular incisor.The animals were sacrificed at 3，5d and 7d respectively（n=5）after injury，the expression of Notch1 and Notch2 in cells of enamel organ was observed by immunohistochemical staining.Animals without crown grinding served as the controls（n=5）.RESULTS：In control group，Notch1 and Notch2 were weakly expressed in stratum intermedium and stellate reticulum cells.3days after injury，an intense expression of Notch1 and Notch2 was observed in ameloblasts and stratum intermedium cells，the expression in stellate reticulum cells was sporadic.5days after injury，Notch1 and Notch2 were still strongly expressed in ameloblasts，stratum intermedium and stellate reticulum cells.7days after injury，the expression of Notch1 and Notch2decreased in all cell layers.CONCLUSION：Notch signaling in enamel organ cells can be activated by mechanical injury，suggesting that Notch signaling may be involved in the repair of incisor injury.

notch signaling；enamel organ cells；incisor；mechanical injury

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A ［文章編號(hào)］1005-2593（2015）04-0193-05

10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.04.002

2014-11-28

國家自然科學(xué)基金（81170947）

尹秋蓉（1983-），女，漢族，四川廣安人。碩士生（導(dǎo)師：王勝朝）

王勝朝，E-mail：wangshengchao@fmmu.edu.cn