李福貴+但唐興+林紹南+鄒曙明

摘要：開展亞東鮭野生群體與人工繁殖后代的形態(tài)特征和微衛(wèi)星遺傳多態(tài)性分析。首先采用方差、判別、主成分分析方法研究了2個群體，包括7個可數(shù)、11個可量與20個框架數(shù)據(jù)，結(jié)果表明亞東鮭人工繁殖后代與野生群體在鰭式、鱗式、可量和框架結(jié)構(gòu)性狀等方面均無顯著差異。進(jìn)一步采用9對微衛(wèi)星引物評估了亞東鮭人工繁殖與野生群體問的遺傳變異，在10個座位中，共檢測到55個等位基因，平均有效等位基因分別為4.8、4.0個，平均每個座位的等位基因數(shù)為5.5個；平均座位觀測雜合度分別為0.6267、0.6417，平均基因多樣性均為0.5719，群體遺傳分化較小，2個群體的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性均呈現(xiàn)低水平。結(jié)果表明，亞東鮭人工繁殖與野生群體在遺傳上差異不大，人工繁殖群體可用于開展進(jìn)一步的保種繁育和保護(hù)性放流工作。

關(guān)鍵詞：亞東鮭；野生群體；人工繁殖群體；形態(tài)特征；微衛(wèi)星多態(tài)性

中圖分類號：S932.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0226-04

亞東鮭（Salmo trutta fraio Linne）屬鮭形目鮭科鮭屬，別稱河鮭（俗稱花點(diǎn)鮭），是冷水性珍稀魚類，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值。關(guān)于亞東鮭的研究較少，張春霖等先后對亞東鮭的來源和資源情況進(jìn)行過分析；蒲德永等對亞東鮭消化系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)進(jìn)行過觀察研究；豪富華等對亞東鮭的性腺發(fā)育生長年齡與繁殖進(jìn)行過研究。在群體遺傳學(xué)方面，豪富華利用線粒體和微衛(wèi)星標(biāo)記對亞東鮭種群和丹麥引進(jìn)棕鱒種群進(jìn)行過群體遺傳多樣性研究，孟瑋等基于線粒體C01基因序列對亞東鮭進(jìn)行了DNA條形碼研究。然而目前關(guān)于亞東鮭人工繁殖后代和野生群體的群體遺傳學(xué)比較研究尚未開展。

亞東鮭自19世紀(jì)由英國人從歐洲引種后，僅棲息于我國西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)亞東縣海拔約3000m的亞東河，1992年已被列入西藏自治區(qū)二級保護(hù)水生動物，尤其是近些年來，野生亞東鮭資源量有加快衰退的趨勢。開展亞東鮭的人工繁殖和放流有利于資源的恢復(fù)，須要選擇具有與原種相似遺傳多樣性的親本，鑒于當(dāng)前野生亞東鮭資源量萎縮，從人工繁殖后代中培育親魚是解決親本來源的有效途徑。有關(guān)于野生和人工繁殖亞東鮭群體間形態(tài)差異及微衛(wèi)星多態(tài)性的研究未見報道，本研究通過分析人工繁殖與野生西藏亞東鮭2個群體間的形態(tài)差異和微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，旨在了解2個群體的遺傳分化特征，為亞東鮭保種繁育和保護(hù)性放流工作提供理論資料。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

于2012年從西藏自治區(qū)日喀則地區(qū)亞東縣亞東河采集野生亞東鮭，先后捕獲30尾，體長、體質(zhì)量分別為（20.42±2.70）cm、（155.01±72.72）g，未進(jìn)行年齡鑒別；亞東鮭人工繁殖岳代1～2齡魚取自西藏亞東鮭漁場，樣本數(shù)量也為30尾，體長、體質(zhì)量均值分別為（16.34±4.26）cm、（92.79±87.98）g，其親本系由亞東河采集的野生個體培育而成。剪魚鰭保存于無水乙醇中，用于抽提基因組DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2形態(tài)特征分析

1.2.1數(shù)據(jù)采集測量的數(shù)據(jù)分為2類：一類是傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，包括可數(shù)、可量性狀共18項(xiàng)，其中可數(shù)性狀包括背鰭、胸鰭、腹鰭、臀鰭鰭條、側(cè)線鱗、側(cè)線上鱗、側(cè)線下鱗；可量性狀有頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長、尾柄高、體長、全長、體高、背棘長、體質(zhì)量。另一類為框架數(shù)據(jù)，共20項(xiàng)，20個框架數(shù)據(jù)是10個定位點(diǎn)之間的距離，例如D1-2表示定位點(diǎn)1與2之間的距離?？蚣軠y量定位點(diǎn)的選擇參照圖1。

1.2.2數(shù)據(jù)處理和多元統(tǒng)計分析為消除魚體規(guī)格大小對形態(tài)分析的影響，每尾魚的所有實(shí)測可量性狀（除體質(zhì)量外）均用體長進(jìn)行校正。再分別求出各組樣本每個參數(shù)的平均比值，用于多元統(tǒng)計分析。分析數(shù)據(jù)包括7個可數(shù)性狀、111個可量性狀及20個框架性狀，分別用方差分析進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，如果方差分析檢驗(yàn)為差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01），則用Duncan's多重比較進(jìn)行分析。

采用逐步判別法對所有的形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，去除判別效果不顯著的參數(shù)，計算判別準(zhǔn)確率和互相證實(shí)準(zhǔn)確率，建立判別方程。判別準(zhǔn)確率P1=判別正確的尾數(shù)/實(shí)際尾數(shù)×100%?；ハ嘧C實(shí)準(zhǔn)確率P2：在共有Ⅳ個樣品中，每次留下一個樣品作為新樣品，由N-1個樣品建立判別函數(shù)，然后將留下的這個樣品代入判別函數(shù)，判別其歸屬，其計算方法同P1。式中：Ai為第i個群體判別正確的尾數(shù)，尾；Bi為第i群體的實(shí)際尾數(shù)，尾；K為群體數(shù)。

主成分分析采用降維計算，是將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)的統(tǒng)計方法。

上述所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3亞東鮭微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

1.3.1簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）引物序列

參考已報道的相關(guān)文獻(xiàn)，共設(shè)計9對SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列與PCR反應(yīng)條件見表1。

1.3.2全基因組DNA提取試驗(yàn)前將魚鰭從乙醇中取出，用蒸餾水洗凈、吸水紙吸干、剪碎，按照海洋動物組織DNA抽提法[由天根生化科技（北京）有限公司提供的試劑盒]抽提全基因組DNA，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的DNA的質(zhì)量、濃度。

1.3.3SSRPCR反應(yīng)體系與程序、PCR產(chǎn)物檢測PCR反應(yīng)體系為25μL：2.5μL10×buffer，1μLdNTP，0.5μLTaq-E，1μL模板DNA。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃再延伸10min；4℃保存。以上反應(yīng)均設(shè)置陰性對照以排除DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有無與量，酌量取PCR產(chǎn)物4～5μL以8%的非變性聚丙烯酰胺凝電泳，0.5×TBE電泳緩沖液，恒壓120V（約2h）進(jìn)行電泳、銀染、顯色、拍照。endprint

1.3.4SSR數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析結(jié)合軟件AdobePhotoshopCS5和AlphaView凝膠圖像分析軟件分析微衛(wèi)星條帶大小，根據(jù)每個個體產(chǎn)生的條件位置確定基因型。用Popgene1.32軟件進(jìn)行分析，計算微衛(wèi)星座位分別在2個群體中的等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、平均基因多樣性指數(shù)，并檢驗(yàn)各個座位、各個群體的哈代一溫伯格平衡。

2.結(jié)果與分析

2.1亞東鮭形態(tài)特征數(shù)據(jù)多元分析

如表2所示，對亞東鮭人工繁殖后代與野生群體的7項(xiàng)可數(shù)性狀求平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，亞東鮭2個群體間的卡方值是x²=0.004；其側(cè)線鱗數(shù)、側(cè)線上鱗、側(cè)線下鱗、背鰭條數(shù)、胸鰭條數(shù)、腹鰭條數(shù)、臀鰭條數(shù)相互差異均不顯著；全長/體長、體長/體高、體長/頭長、頭長/吻長、頭長/眼徑、頭長/眼間距、體長/尾柄長、尾柄長/尾柄高、背棘長/體長等9個比例性狀的測量結(jié)果也不存在顯著差異。

采用方差、判別和主成分等方法分析了2個群體包括7個可數(shù)、111個可量、20個框架數(shù)據(jù)的形態(tài)特征。結(jié)果表明，9個比例性狀在野生和人工繁殖2個群體間差異均不顯著，相似性狀比例為100%；29個可量和框架數(shù)據(jù)在野生和人工繁殖兩群體間差異均不顯著，相似性狀比例為100%。主成分分析得到因子1-11的方差累積貢獻(xiàn)率在85%以上，但各自特征根極小，且對群體間總方差的貢獻(xiàn)率小，無法用相互獨(dú)立的因子來概括這2個群體魚的形態(tài)差異。用逐步判別程序?qū)?jīng)過校正的29個形態(tài)參數(shù)進(jìn)行篩選，淘汰掉26個形態(tài)參數(shù)，得到D4-1/體長、眼徑/體長、背棘長/體長等3個判別效果稍微顯著的形態(tài)參數(shù)。計算得到2個群體判別準(zhǔn)確率及互相證實(shí)準(zhǔn)確率較低，分別為84.99%、85.04%（表3），即亞東鮭野生和人工繁殖后代2個群體易發(fā)生錯判，也進(jìn)一步證實(shí)了它們間不存在顯著的形態(tài)差異。

2.2亞東鮭野生和人工繁殖群體的微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析

采用9對微衛(wèi)星引物擴(kuò)增出10個多態(tài)性座位，獲得55個等位基因，平均每個座位擴(kuò)增出5.5個等位基因。不同的微衛(wèi)星擴(kuò)增出的等位基因數(shù)量不同，其中最多的是引物Strutta58，共擴(kuò)增出10個等位基因，最少的是引物Str43INRA，共擴(kuò)增出2個座位及5個等位基因（表4）。另外，不同微衛(wèi)星引物在2個群體中可擴(kuò)增出不同的基因數(shù)，如引物Strutta58在亞東鮭人工繁殖群體中擴(kuò)增出8個等位基因，而在野生群體中擴(kuò)增出5個等位基因，且有的個體中出現(xiàn)了無效等位基因。

從表5中可以看出，座位Str43INRA-1和Str43INRA-2在亞東鮭2個群體中均嚴(yán)重偏離哈代一溫伯格平衡，其余8個座位在2個群體中均符合哈代一溫伯格平衡。計算得亞東鮭人工繁殖群體和野生群體的平均等位基因數(shù)分別是4.8、4.0，平均觀測雜合度分別是0.6267、0.6417，平均基因多樣性指數(shù)均為0.5719。人工繁殖群體平均等位基因數(shù)多于野生群體，而人工繁殖群體平均觀測雜合度略小于野生群體，但差異都不顯著。

3.討論與結(jié)論

3.1亞東鮭人工繁殖后代與野生群體的形態(tài)特征

亞東鮭人工繁殖后代與野生群體在形態(tài)學(xué)上差異不顯著。在7個可數(shù)性狀中，鰭式和鱗式都相似，沒有差異；9個比例性狀在兩群體間差異均不顯著；29個可量和框架數(shù)據(jù)在2個群體間的差異也不顯著，相似性狀比例為100%；主成分分析和判別分析也進(jìn)一步證實(shí)了它們之間不存在顯著性形態(tài)差異。亞東鮭漁場建于亞東河邊并直接把河水引入池中進(jìn)行流水養(yǎng)殖和繁育，養(yǎng)殖環(huán)境如水質(zhì)、水溫、光照、溶氧、餌料等與亞東河自然條件基本一致，2個群體在形態(tài)學(xué)上差異不顯著，表明人工繁殖后代沒有因人工繁殖和養(yǎng)殖操作產(chǎn)生形態(tài)遺傳特征的改變。

3.2亞東鮭2個群體的微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性

微衛(wèi)星無效等位基因普遍存在于微生物、動物、植物等眾多物種中。微衛(wèi)星側(cè)翼序列變異、大片段等位基因丟失、不同微衛(wèi)星位點(diǎn)對DNA質(zhì)量要求差異等都是造成無效等位基因的原因。本研究所用微衛(wèi)星引物都通過篩選所得，且不存在大片段等位基因丟失現(xiàn)象，因此主要原因可能是由于樣品采集路途遙遠(yuǎn)、保存條件有限而導(dǎo)致DNA樣品質(zhì)量不太符合微衛(wèi)星位點(diǎn)的要求。另外，微衛(wèi)星無效等位基因具有隱匿性，且在雜合子個體中表現(xiàn)更為常見，這與本研究中人工繁殖群體雜合度比野生群體低相符，野生群體無效等位基因出現(xiàn)更多。因此，10個微衛(wèi)星位點(diǎn)中8個位點(diǎn)都出現(xiàn)無效等位基因，導(dǎo)致各位點(diǎn)基因頻率在兩群體中具有一定的差異，但結(jié)合各位點(diǎn)雜合度等分析兩群體遺傳差異不明顯。

引物Str43INRA擴(kuò)增出2個位點(diǎn)為Str43IRNA-1、Str43IRNA-2。根據(jù)鯉魚和草魚相關(guān)報道可以推測，出現(xiàn)這種情況是因?yàn)閬問|鮭曾經(jīng)經(jīng)歷過特有的全基因組重復(fù)。雜合度、等位基因多樣性和多態(tài)性位點(diǎn)的比例等是評估遺傳多樣性最常用的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，亞東鮭野生群體和人工繁殖后代中的微衛(wèi)星雜合子均嚴(yán)重缺乏，位點(diǎn)$sa85在2個群體均嚴(yán)重偏離哈代一溫伯格平衡，人工選擇、遷移、突變、近交等都有可能產(chǎn)生該現(xiàn)象。亞東鮭最早引入亞東河并棲息下來時的個體數(shù)量少，導(dǎo)致遺傳瓶頸和漂變的發(fā)生可能是雜合子急劇減少和檢測到偏離哈代一溫伯格平衡的主要原因。本研究表明，亞東鮭人工繁殖群體的平均等位基因數(shù)大于野生群體，也從不同角度證明亞東鮭野生資源正在經(jīng)歷一個急劇衰退的過程，需要加強(qiáng)亞東鮭的保護(hù)性繁育和增殖。

豪富華等報道亞東鮭野生群體的平均觀測雜合度分別是0.7083，而本研究的亞東鮭野生群體、人工繁殖后代的觀測雜合度為0.6417、0.6267，均顯著低于2006年所取的亞東鮭野生群體的雜合度，這說明亞東鮭種群的遺傳多樣性處于下降趨勢。同時，亞東鮭人工繁殖群體的遺傳雜合度略小于野生群體，但2個群體遺傳雜合度差異不顯著，說明亞東鮭漁場多年來陸續(xù)收集和培育的野生親本群體基本保留了目前野生群體的遺傳多樣性，應(yīng)可用于野生資源的恢復(fù)和增殖工作。endprint