李曉丹　夏冰　汪仁

摘要：為了進一步研究基因工程菌E.coli B121（DE3）/pET-29a-cct在培養(yǎng)基中傳代50次過程中菌種的穩(wěn)定性，通過將菌體和菌落的形態(tài)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、質(zhì)粒酶切圖譜和重組CCT酶的表達(dá)量及活性作為指標(biāo)進行考察，來評價該工程菌的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，重組CCT酶基因的工程菌在轉(zhuǎn)接50次的過程中質(zhì)粒穩(wěn)定性高，其保有率為90%，表達(dá)產(chǎn)物可達(dá)發(fā)酵液總蛋白的15%以上。該菌在第50代后仍具有轉(zhuǎn)化活性，說明工程菌轉(zhuǎn)化活性穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶（ccT酶）；質(zhì)粒穩(wěn)定性；工程菌穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)化活性

中圖分類號：Q939.9 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0049-02

大腸桿菌遺傳背景清楚，生長迅速，發(fā)酵周期短，是基因工程的主要受體菌，已得到廣泛應(yīng)用。然而，克隆有外源基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞之后，會產(chǎn)生一系列的負(fù)面生理效應(yīng)，從而影響其穩(wěn)定性。外源基因表達(dá)后，增加了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，質(zhì)粒穩(wěn)定性會下降。一般來說，丟失質(zhì)粒的細(xì)胞往往比含有質(zhì)粒的細(xì)胞具有更高的生長速率。基因工程菌的質(zhì)粒不穩(wěn)定現(xiàn)象在生產(chǎn)實踐中普遍存在，這導(dǎo)致對它的應(yīng)用受到一定的限制。通常質(zhì)粒穩(wěn)定性的高低是影響發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，質(zhì)粒丟失會導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白產(chǎn)量下降，進而影響發(fā)酵產(chǎn)物的收率，還可能造成較大的經(jīng)濟損失。

磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶（CCT酶）可直接催化胞苷三磷酸（CTP）和磷酸膽堿合成胞二磷膽堿。在之前的研究中，本課題組已克隆到釀酒酵母磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶基因（cct）并插入表達(dá)載體pET29a（+）中，成功構(gòu)建了重組工程菌E.coliBL21（DE 3）/pET-29a-cct，獲得了具有催化活性的工程菌株。該工程菌株具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景，為確保生產(chǎn)中菌種的穩(wěn)定性，進一步對該重組工程菌的穩(wěn)定性進行研究具有相當(dāng)重要的實際意義。

1.材料與方法

1.1材料和培養(yǎng)基

重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-29a-cct由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所分子實驗室構(gòu)建。除發(fā)酵培養(yǎng)基外，使用的皆為LB培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基配方：Na2HPO4·12H2O24.0g，KH2PO4 4.9g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCl20.1g，酵母粉5.0g，蛋白胨5.0g，pH值調(diào)至7.2，121℃滅菌20min.

1.2方法

1.2.1菌種的傳代將保存于-80℃冰箱中的原始菌株大腸桿菌BL21（DE3）/pET-29a-cct劃線于含卡那霉素（50ug/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，再挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。按1%接種量將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于不含抗生素的lJH液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，每轉(zhuǎn)接1次計傳代1次，共轉(zhuǎn)接50次。分別取第10、20、30、40、50次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物500uL，加入甘油（終濃度為30%），保存于-80℃冰箱中，備用。

1.2.2工程菌形態(tài)的觀察取樣后菌體用生理鹽水洗滌3次后，再用少量的生理鹽水懸浮。制片并進行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3平板稀釋計數(shù)法將連續(xù)搖瓶培養(yǎng)試驗轉(zhuǎn)接的第10、20、30、40、50代取樣進行平板稀釋檢測質(zhì)粒的缺失程度。檢測時，取菌液1mL用無菌水逐級稀釋，取3個合適的梯度，分別涂在固體選擇性培養(yǎng)基和非選擇性培養(yǎng)基平板上，每個處理3次重復(fù)。倒置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，計算培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，根據(jù)選擇性培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與非選擇性培養(yǎng)基中菌落數(shù)的比值，即可計算出質(zhì)粒的缺失率。

1.2.4質(zhì)粒酶切圖譜的鑒定采用堿裂解方法從第10、20、30、40、50代菌體中提取質(zhì)粒，0.75%瓊脂糖凝皎電泳檢測。為確定CCT酶編碼基因的穩(wěn)定性，進一步將各代菌所提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Nde 和Xho I進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5重組CCT酶的表達(dá)穩(wěn)定性及酶活鑒定取0、10、20、30、40、50代菌種，分別接種于液體lJH培養(yǎng)基中，37 qC振蕩過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接于新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3～5h，加入IPTG（終濃度為1mmol/L）30℃誘導(dǎo)表達(dá)10h，取1mL菌液，于12000r/min離心2min，收集菌體并重懸于500uL1×SDS加樣緩沖液，沸水浴中煮沸10min以充分裂解細(xì)胞，12000r/min室溫離心10min，使細(xì)胞碎片及DNA等沉淀，取適量溶液上樣，SDS-PAGE分析。粗酶液制備及酶活測定方法參照文獻[3]。

2.結(jié)果與分析

2.1工程菌形態(tài)

將取樣的各代菌體進行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下可見形態(tài)均勻一致的革蘭氏陰性短桿菌，劃線培養(yǎng)未見雜菌生長，菌體和菌落的形態(tài)均正常。

2.2種子液選擇壓力對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響

通過添加抗生素可選擇性使得只有那些保留相應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞才能夠生長，采取施加選擇壓力可以用來消除重組質(zhì)粒的分配性不穩(wěn)定。在種子培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0、10、20、50ug/mL卡那霉素，37℃振蕩培養(yǎng)24h后，采用平板稀釋計數(shù)法考察工程菌質(zhì)粒的缺失情況，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，當(dāng)種子培養(yǎng)基中沒有添加抗生素時，質(zhì)粒有一定程度的丟失，當(dāng)卡那霉素濃度大于20ug/mL時，質(zhì)粒保有率為100%。

2.3重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性

在無選擇壓力的培養(yǎng)條件下，若重組菌丟失質(zhì)粒，由于其沒有額外的代謝負(fù)擔(dān)，隨著傳代次數(shù)的增加最終可取代帶有質(zhì)粒的工程菌，從而導(dǎo)致發(fā)酵失敗，因此還需檢測在無選擇壓力的培養(yǎng)基中工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

試驗結(jié)果表明，經(jīng)傳代10次后，工程菌中的質(zhì)粒保有率為100%，20代后工程菌中質(zhì)粒的保有率開始下降，第20代為98%，第30代為95%，第40代為92%，50代后的菌種質(zhì)粒保有率仍保持90%，表明工程菌在未加抗生素的培養(yǎng)基中傳代，重組質(zhì)粒仍可以在工程菌中穩(wěn)定存在。

由圖1可以看出，工程菌在傳代50次后仍帶有質(zhì)粒，說明重組質(zhì)粒在工程菌中穩(wěn)定性較好。為確定CCT酶編碼基因在反復(fù)傳代后的穩(wěn)定性，將從各代菌體中提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Ned I和Xho I雙酶切后，上樣，用O.75%瓊脂糖凝膠電泳。由于原始質(zhì)粒pET-29a-cct上CCT酶的編碼基因為1275bp，質(zhì)粒pET29a（+）全長位5371bp，從圖2可見，在1.3kb和5.3kb）處各有1個條帶，這與理論值相符。質(zhì)粒電泳和酶切驗證的結(jié)果表明：經(jīng)傳代后的工程菌保留了原重組質(zhì)粒，質(zhì)粒骨架與重組基因的大小均未發(fā)生改變，說明工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-29a-cct人工傳代50次后，質(zhì)粒仍穩(wěn)定存在。

2.4CCT酶的表達(dá)及活性穩(wěn)定性

電泳的結(jié)果（圖3）顯示，在50ku附近有1條帶，和CCT酶分子量理論值相符合，各代之間無明顯差異。電泳結(jié)果表明，工程菌在傳代50次的過程中，CCT酶的表達(dá)穩(wěn)定，CCT酶的表達(dá)量占發(fā)酵液中總蛋白的15%以上。酶活檢測顯示工程菌粗酶液在第50代后仍具有活性，酶活為0.04U/mL，說明該工程菌的CCT酶活性穩(wěn)定。

3.討論

在本實驗室成功構(gòu)建獲得了具有磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶催化活性的基因工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-29a-cct后，為進一步了解該工程菌的穩(wěn)定性，本研究通過多次傳代來考察該工程菌中重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性，同時鑒定了該工程菌在反復(fù)傳代后外源蛋白的表達(dá)及其活性的穩(wěn)定性。

質(zhì)粒的不穩(wěn)定性可分為2種——結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和分裂不穩(wěn)定性。在本研究采用的試驗方法和條件下，該基因工程菌在連續(xù)傳代50次后，提取質(zhì)粒酶切驗證后證明外源基因片斷沒有丟失，說明該質(zhì)粒具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；但是在無抗生素選擇壓力的培養(yǎng)條件下，傳代20代后開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的細(xì)胞，連續(xù)傳代50次后，約有90%的細(xì)胞含有正常質(zhì)粒，該基因工程菌表現(xiàn)出一定的分裂不穩(wěn)定性。為了保證該基因工程菌的正常生長及CCT酶的表達(dá)，在種子液中添加卡那霉素可以在一定程度上保證該基因工程菌的穩(wěn)定性。因此該基因工程菌在質(zhì)粒穩(wěn)定性方面滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，可以應(yīng)用于擴大生產(chǎn)。

基因工程菌產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的最大障礙在于保存及培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出的傳代不穩(wěn)定性。試驗結(jié)果表明，本實驗室構(gòu)建的酵母磷酸膽堿胞苷轉(zhuǎn)移酶工程菌在傳代過程中的質(zhì)粒未發(fā)生明顯丟失，也未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而且傳至50代次岳仍保留重組質(zhì)粒，并保持原代菌種的卡那霉素抗性、生物催化活性及其他生理特征，表明此工程菌適合于工業(yè)化生產(chǎn)。