李　薇，梁　慶，張　潮，蘇丹萍,3，賀　濤,4，崔大方

（1.華南農業(yè)大學 林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省樂昌林場，廣東 樂昌 512219；3.南寧市人民公

園，廣西 南寧 530012；4.廣州南沙明珠灣區(qū)開發(fā)有限公司，廣東 廣州 511455）

紅皮糙果茶種子生活力測定與發(fā)芽試驗

李薇1，梁慶2，張潮1，蘇丹萍1,3，賀濤1,4，崔大方1

（1.華南農業(yè)大學 林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省樂昌林場，廣東 樂昌 512219；3.南寧市人民公

園，廣西 南寧 530012；4.廣州南沙明珠灣區(qū)開發(fā)有限公司，廣東 廣州 511455）

選取飽滿有光澤的紅皮糙果茶Camellia crapnelliana種子，進行種子貯存生活力測定、種子發(fā)芽試驗及種皮解剖結構觀察等研究，就種子繁殖探討其瀕危原因。結果表明，有利于保持種子生活力的貯存方式為：4 ℃貯存>常溫貯存>-10 ℃貯存；種子發(fā)芽試驗中，采用不同濃度赤霉素(GA3)、吲哚丁酸(IBA)和不同溫度溫水處理，種子發(fā)芽率均不高，最高為40%；不同因素對種子發(fā)芽的影響不同，種子發(fā)芽最佳處理為800 mg·L-1GA3浸泡6 h；種皮解剖結構觀察到紅皮糙果茶種皮堅硬，由栓化壁和骨狀石細胞組成，內、外部石細胞垂直交錯排列，這可能是造成種子萌發(fā)困難的機械阻礙原因。

紅皮糙果茶；種子生活力；發(fā)芽試驗；種皮結構

紅皮糙果茶 Camellia cra pnelliana又名克氏茶、紅皮油茶、紅皮山茶和八瓣糙果茶，屬山茶科Theaceae山茶屬Camellia糙果茶組Sect. Furfuraceae植物。常綠小喬木，高可達10 m；樹皮表面有鐵銹色至磚紅色粉狀物，細枝無毛；葉厚革質，葉緣有細齒，葉脈明顯；花白色，有麝香味，單生或簇生于枝頂或葉腋，花徑4～10 cm；雄蕊約150枚，無毛；雌蕊花柱3條，基部離生，下部有毛，子房被絨毛；蒴果卵球形，長7.0～11.4 cm，直徑7.8～12.0 cm，表面糠秕狀粗糙，每果有種子6～18粒；花期秋季。

紅皮糙果茶是在1903年由香港前林務監(jiān)督在香港柏架山首次發(fā)現(xiàn)，并命名為“克氏茶”，現(xiàn)在福建、廣東、廣西南部、江西東部及浙江南部發(fā)現(xiàn)有分布[1]。目前，福建德化、永安、大田、古田、屏南、政和等縣及香港九龍半島馬鞍山已引種栽培[2]。

紅皮糙果茶花大芳香，樹干顏色與葉片革質亮綠形成對比，且種子含油豐富，產油率達17%～35%，是很有價值的觀賞植物和油料植物[3—4]。由于野生資源數(shù)量稀少，1992年被列入《中國植物紅皮書》，為國家二級保護植物[5]，2004年被《中國物種紅色名錄》列為極危種[6]。目前對紅皮糙果茶的研究僅在葉片光合特性、種子含油量和園林應用等方面有少量報道[7—10]。本文對紅皮糙果茶種子生活力、發(fā)芽率及種皮解剖結構進行試驗和觀察，并由此探討其瀕危原因。

1　材料與方法

1.1材料

2012年10月于中山大學南校區(qū)竹園和華南植物園山茶專類園采收紅皮糙果茶果實。將成熟果實置于室內通風處，使其自然開裂，收集種子。

1.2方法

1.2.1種子生活力測定選取飽滿有光澤種子90粒，分成3份，每份30粒，裝入自封袋中，分別貯存在冰箱保鮮層(BX0，4 ℃）、冰箱冰凍層(BD0，-10 ℃）及室內常溫(CW，20～30 ℃)。

在三種環(huán)境下貯存1月后，每組取10粒種子，重復3次，將水煮5 min的種子作為對照組(CK)，采用紅四氮唑(TTC)定量法測定種子活力。將待測種子浸泡至充分吸脹，除去種皮，剝出種胚。將樣品放進具塞試管中，加入10 mL 0.1% TTC溶液，于38 ℃左右的恒溫水浴中黑暗下染色2 h，自來水沖洗樣品2～3次，濾紙吸干浮水，觀察樣品染色部位和程度。然后將樣品全部倒入研缽，加少許石英及乙醇，充分研磨，將研磨液全部倒入容量瓶中，定容并搖勻。再將部分提取液倒入10 mL離心管中，于10 000 r·min-1離心5 min，吸出一定量的上清液供比色用。最后用分光光度計于490 nm處測定并比較光密度值，評價各樣品種子生活力[11]。

1.2.2種子發(fā)芽試驗基質為河沙，用0.2% KMnO4溶液消毒，覆膜2 d，揭開后用自來水沖洗3次，并晾曬1 d。沙床厚度為15 cm，覆蓋石棉瓦進行保濕和遮蔭。

用0.5% KMnO4溶液浸泡種子消毒15 min，自來水沖洗干凈。用赤霉素(GA3)、吲哚丁酸(IBA)和溫水處理，GA3和IBA的濃度梯度為400、800、1000mg·L-1，溫水的溫度梯度為30、50、70 ℃，處理時間梯度為6、12、24 h。對不同處理濃度、處理時間采用三因素三水平進行正交試驗設計，試驗中設清水對照組(表1)。每處理20粒種子，3次重復。30 d計算發(fā)芽勢，45 d統(tǒng)計發(fā)芽率并測量根長和根粗。

表1　紅皮糙果茶播種試驗設計Table 1　Seed germination experiment of Camellia crapnelliana

1.2.3石蠟切片將種皮剪成1 cm ×1 cm的小塊，用FAA固定液浸泡，固定24 h以上。在脫水之前，將固定的種皮置于燒杯中，用水反復煮沸，使其軟化。常規(guī)石蠟切片法制片[12]，番紅固綠對染，加拿大樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察，用Motic Images Advanced 3.2軟件測量和拍照。

2　結果與分析

2.1種子生活力

經0.1% TTC水浴染色2 h后，若種胚為紅色則代表種子具有生命力，且顏色越深則生活力越大。統(tǒng)計每組種胚被染色情況，貯存于冰箱保鮮層的種子平均染紅數(shù)為8.3粒，其中有2.3粒為淺紅；貯存于冰箱冰凍層的種子平均染紅數(shù)為1.3粒，其中1.0粒為淺紅；貯存于常溫的種子平均染紅數(shù)為9.3粒，其中3.0粒為淺紅；對照組的種子均死亡，沒有染紅。由表2可知，在染紅數(shù)和深紅數(shù)的數(shù)量指標上，冰箱冰凍層的種子生活力明顯低于冰箱保鮮層和常溫貯存的種子，且差異達顯著水平，但冰箱保鮮層和常溫的差異不顯著。因此，冰箱冰凍層不宜貯存紅皮糙果茶種子。

為進一步確定種子貯存的最佳條件，采用分光光度計于490 nm處測定光密度值。冰箱保鮮層的種子平均光密度值為0.061，冰箱冰凍層的平均光密度值為0.027，常溫的平均光密度值為0.048，煮死的種子平均光密度值為0.025(表2)。保鮮層的種子平均光密度值顯著高于其他處理，冰凍層與CK差異不顯著，均低于常溫貯存和保鮮層貯存的種子。光密度值高，表明種子生活力強，光密度值測定結果與種胚染色反映的種子生活力情況相符，進一步表明冰箱保鮮層的種子生活力高于其他處理。

表2　不同貯存環(huán)境下種子TTC染色情況和測定光密度值Table 2　Situation and optical density value of seeds after TTC test in different store environments

紅皮糙果茶種子為油脂類種子，水分缺失是威脅種子生活力的主要因素之一。如圖1所示，在兩種貯存條件下，種子初期失水速率均較慢，至貯存7 d后急劇下降，失水明顯，因而種子采收后應在一周內進行播種，超過一周后種子的失水會明顯增加。存于冰箱保鮮層的種子總體失水率明顯低于常溫下的種子，因此貯存于冰箱保鮮層內的種子生活力優(yōu)于常溫下的種子。綜上所述，紅皮糙果茶種子貯存的最佳方式為冰箱保鮮層(4 ℃)貯存，其次為常溫貯存，冰箱冰凍層最差。

圖1　紅皮糙果茶種子的失水率Fig. 1　Loss water ratio of Camellia crapnelliana seeds

2.2種子發(fā)芽正交試驗

由表3可見，經50 ℃溫水處理6 h的種子發(fā)芽率最高，為40%；其次為400 mg·L-1GA3處理6 h和800 mg·L-1IBA處理24 h，發(fā)芽率均為36.67%，均高于對照組。而800 mg·L-1GA3處理12 h和70 ℃溫水處理12 h的種子發(fā)芽率均為0，70 ℃溫水處理12 h種子可能因為水溫偏高而失去生活力。從發(fā)芽勢來看，400 mg·L-1GA3處理6 h的種子在第20 d開始萌動，萌芽最早，且發(fā)芽最整齊，平均根長最長，達7.03 cm；其次為50 ℃溫水處理6 h的種子，發(fā)芽勢為26.67%；但平均根粗則以400、800 mg·L-1IBA分別處理12、24 h的種子較好。

極差分析表明，影響種子發(fā)芽率的主次因素依次為C > B > A，即處理時間對發(fā)芽率影響最大，為最主要因素，最優(yōu)方案為A1B2C1，即800 mg·L-1GA3處理6 h；影響種子發(fā)芽勢的主次因素為C > A > B，即處理時間對發(fā)芽率影響最大，為最主要因素，最優(yōu)方案為A1B2C1，與發(fā)芽率的最優(yōu)方案相同；影響種子發(fā)芽平均根長的主次因素為C > B > A，即處理時間為主要因素，最優(yōu)方案為A1B1C3，即400 mg·L-1GA3處理24 h；影響種子平均根粗的主次因素為C > A > B，即處理時間為主要因素，其次為試劑，最優(yōu)方案為A2B1C3，即400 mg·L-1IBA處理24 h(表3)。此外，從B × C交互列的極差可以看出，濃度和時間的交互作用對各個指標都有重要的影響，因此后續(xù)試驗中應注意濃度和時間的合理搭配。

表3　紅皮糙果茶種子發(fā)芽正交試驗Table 3　Results of seed germination test of Camellia crapnelliana

通過綜合平衡法分析，對于前三個指標來說，因素A均以A1為最佳水平，對于平均根粗則以A2為佳，但對于根粗A為較次要因素，因此因素A選取A1水平。就因素B而言，發(fā)芽率和發(fā)芽勢兩個指標以取B2為佳，對于平均根長和平均根粗則取B1較好，對于四個指標，B為較次要的因素，而且指標中以發(fā)芽率最為重要，故選取B2水平。C因素是影響四個指標最主要的因素，在確定最優(yōu)水平時應重點考慮，其中，對于發(fā)芽率和發(fā)芽勢兩個指標來說，以C1最佳，而對于另兩個指標，C1和C3相差不大，故根據(jù)指標的重要程度，取C1水平。因此，正交試驗設計得到綜合的最優(yōu)方案為A1B2C1，即800 mg·L-1GA3處理6 h。

2.3不同因素對紅皮糙果茶種子胚根生長的影響

方差分析表明，影響紅皮糙果茶種子發(fā)芽平均根長的主要因素有濃度(B)、時間(C)及兩者的交互作用(B × C)，且均達極顯著水平(P<0.01)，試劑因素(A)則達顯著水平(P<0.05)，表明濃度和時間對紅皮糙果茶種子發(fā)芽后的根長生長具有更重要的影響(表4)。

表4　紅皮糙果茶種子根長方差分析Table 4　Analysis of variance on average root length of Camellia crapnelliana seed germination

不同因素對平均根長的多重比較顯示，濃度為400 mg·L-1最利于根長生長，與其他兩個濃度之間達顯著差異；從時間因素分析，以6 h和24 h最利于根長生長；從試劑因素分析，GA3更有利于根長生長，與溫水處理達顯著差異(表5)。

表5　不同因素對平均根長影響的多重比較Table 5　Multiple comparison analysis on effect of different factors on average root length

從表6可見，試劑、濃度、時間及濃度和時間交互作用對紅皮糙果茶種子根粗的影響均達到極顯著水平，其作用順序為：時間 > 濃度和時間交互作用 > 濃度 > 試劑。

表6　紅皮糙果茶種子根粗方差分析Table 6　Analysis of variance on average root diameter of Camellia crapnelliana seeds

不同因素對平均根粗的多重比較顯示，濃度為400 mg·L-1最利于根的增粗，與其他兩個濃度之間達顯著差異；從時間因素分析，三個水平之間均達顯著差異，以處理24 h對發(fā)芽后根粗生長效果最佳；從試劑因素分析，IBA更有利于根的增粗，與GA3和溫水處理達顯著差異(表7)。

表7　不同因素對根粗影響的多重比較Table 7　Multiple comparison analysis on effect of different factors on average root diameter

綜上分析，GA3對促進種子萌發(fā)和胚根的伸長具有明顯作用，IBA對胚根的增粗生長具有明顯的促進作用；在試劑濃度使用上，以高濃度短時間處理對種子的發(fā)芽具有明顯促進作用，而低濃度長時間處理對種子的后期發(fā)育有明顯促進作用；試劑的處理時間對紅皮糙果茶的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢影響最大，時間太短效果沒達到最佳，時間太長對發(fā)芽起到抑制作用。

2.4種皮結構

紅皮糙果茶的種皮較堅硬，由栓化壁和石細胞組成(圖2: A)。栓化壁厚度為23.94 μm；石細胞層數(shù)較多，根據(jù)石細胞的排列形態(tài)，可將其分為外部石細胞和內部石細胞兩部分(圖2: B, C)。兩部分石細胞均為骨狀石細胞，具單紋孔。外部石細胞厚度為604.77 μm，內部石細胞厚度為829.17 μm，兩者呈垂直交錯排列。栓化壁和排列緊密的石細胞可能是造成種胚萌發(fā)的機械障礙。

圖2　紅皮糙果茶的種皮結構Fig. 2　Testa structure of Camellia crapnelliana seedA.種皮結構; B.種皮外部石細胞; C.種皮內部石細胞

3　討論

3.1貯存方式對種子生活力的影響

Roberts[13]根據(jù)種子的貯藏特性將其分成兩大類，即正常型種子和頑拗型種子，頑拗型種子成熟脫落時含水量較高，輕度脫水后生活力顯著下降。山茶屬多數(shù)種類的種子屬于頑拗型種子[14]，常用的貯存方法有：用籮筐等盛裝種子，儲存于 20 ℃以下干燥通風的室內，一般在冬季可儲存50～60 d；沙藏于干燥通風良好的室內，可儲存120 d左右；用編織袋和麻袋等盛裝種子，儲存于5～6 ℃干燥通風的低溫冷庫中，可儲存1年左右[15]。

將紅皮糙果茶種子置于常溫、冰箱保鮮層和冰箱冷凍層三種環(huán)境下，結果表明，貯存于保鮮層的種子生活力最高，與冰凍層種子生活力差異顯著。置于冰箱冰凍層的種子生活力接近于開水煮死的種子，與頑拗型種子對低溫非常敏感的觀點是一致的[13]。

山茶屬植物種子的短期保存方法較多，但不能保證種子播種后有較高的發(fā)芽率，生產中常將油茶種子帶果殼貯存，可以保存 7～10月，且能提高發(fā)芽率。近年來，人們對油茶種子種質的超低溫保存進行了探索性研究，以期能夠長期保存種質。本研究表明，紅皮糙果茶種子短期貯存的最佳方式為存放于冰箱保鮮層(4 ℃)，但后期的發(fā)芽情況有待進一步研究。

3.2不同因素對種子發(fā)芽的影響

GA3較IBA對促進種子萌發(fā)和胚根伸長的作用更加明顯，與楊成利等[16]報道的用GA3處理耐冬山茶Camellia japonica種子發(fā)芽效果一致，IBA則主要表現(xiàn)在促進胚根的增粗。從溫度因素分析，水溫越高，軟化種皮和解除休眠效果越好，50 ℃時發(fā)芽率最高，但種子不能耐受過高溫度，70 ℃時被致死，與袁軍等[17]報道的油茶Camellia oleifera種子發(fā)芽效果一致。濃度和時間對種子發(fā)芽的交互作用明顯，高濃度試劑短時間處理對種子發(fā)芽具有明顯的促進作用，而低濃度長時間處理對種子的后期發(fā)育有明顯的促進作用，高濃度長時間處理則對種子發(fā)芽起到抑制作用。

3.3造成物種瀕危狀態(tài)的原因

3.3.1生活力對萌發(fā)的影響種子生活力是指種子能夠萌發(fā)的潛在能力或種胚具有的生命力。紅皮糙果茶種子在20～30 ℃和4 ℃環(huán)境下短期貯存后生活力水平較高，種子仍具有萌發(fā)潛在能力。然而，野生環(huán)境下種子成熟后會從植株脫落下來，含油量高的種子會吸引昆蟲啃食；種子若長期不萌發(fā)，所含油分會導致種子酸敗而失去生活力；隨著貯存溫度的降低，種子的生活力也逐漸地減弱，在-10 ℃環(huán)境下短期貯存的種子幾乎失去生活力，不能萌發(fā)。雖然紅皮糙果茶的種子數(shù)量多，但野生環(huán)境下種子受到昆蟲威脅，且遇到低溫會喪失生活力，種子無法及時繁衍，易造成物種瀕危。

3.3.2種皮結構對萌發(fā)的影響種皮一方面對種子種胚起保護作用，但同時也成為阻礙種子萌發(fā)的主要因素。Wolfgang[18]研究認為，種皮對種子萌發(fā)的阻礙作用可能是由于種皮結構的物理特性造成，導致種子對外界水分、氣體等成分通透性的改變。紅皮糙果茶種皮具有許多穿孔，沒有完全阻隔種胚與外界進行物質交換，但石細胞層數(shù)多，排列緊密。因此，從結構上來看，種皮一方面木質化嚴重，阻礙種子萌發(fā)；另一方面，因穿孔形成良好的種皮通透性致使子葉和胚易失水而失活。紅皮糙果茶種子發(fā)芽率不高，除了種皮機械阻礙因素外，種子內是否含有萌發(fā)抑制物有待進一步驗證。

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Seed Viability and Germination Test on Camellia crapnelliana

LI Wei1, LIANG Qin2, ZHANG Chao1, SU Dan-ping1,3, HE Tao1,4, CUI Da-fang1
(1.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong China;
2.Lechang Forest Farm of Guangdong Province, Lechang 512219, Guangdong China; 3.Nanning People’s Park, Nanning
530012, Guangxi China; 4.Guangzhou Nansha Pearl Bay Development Co. Ltd., Guangzhou 511455, Guangdong China )

The wild resource of Camellia crapnelliana had been badly damaged and it was listed as critically endangered species, growing only in a narrow geographical range. To explore its endangered causes, seed propagation mode was carried out. Used plump and shiny C. crapnelliana seeds as material, seed storage viability, seed germination and seed anatomical characteristics observation were determined. The results showed that the highest seed viability for seeds of C. crapnelliana was stored in refrigerator layer (4 ℃), and the worst was stored in freezer frozen layer (-10 ℃). In seed germination test, seed germination rate was not high (≤40%), and the influence of different factors was different, the optimum treatment to improve seed germination rate was 6-hour immersion in 800 mg·L-1GA3. The testa of C. crappnelliana was hard, consisting of suberized wall and sclereid, which may be the mechanical barrier for embryo germination.

Camellia crapnelliana; seed viability; seed germination test; testa structure

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.02.003

Q945.34

A

1009-7791(2015)02-0101-06

2015-04-02

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新專項(2011KJCX003)；廣東省科技計劃項目(2013B060400019)

李薇，碩士，從事生物技術與園林植物資源研究。E-mail: liwei6237362@126.com

注：崔大方為通訊作者。E-mail: cuidf@scau.edu.cn