呂 平， 杜國(guó)冬， 韋麗君， 黃 強(qiáng)*， 農(nóng)耀京， 呂麗蘭

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001；2.農(nóng)業(yè)部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，廣西南寧 530001；3.廣西亞熱帶優(yōu)勢(shì)作物繁育及綜合開(kāi)發(fā)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一類廣譜性農(nóng)藥，其殺蟲(chóng)效果好，具有高效、低毒、選擇性高和持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)[1]。目前，中國(guó)與東盟農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易越來(lái)越頻繁，因此，對(duì)東盟水果中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)就顯得十分重要。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法有很多，主要有薄層層析法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等[2 - 4]。采用氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法，高溫氣化部分化合物可能分解，干擾物多；高效液相色譜-質(zhì)譜法靈敏度高，檢測(cè)效果好，但其設(shè)備昂貴，普通的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法滿足該要求。

利用高效液相色譜-柱后衍生技術(shù)，使氨基甲酸酯類化合物經(jīng)過(guò)衍生生成具有熒光的物質(zhì)，通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)，可以大大提高靈敏度，降低分析成本。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)東盟水果提取體系以及凈化方法進(jìn)行研究，建立了檢測(cè)東盟水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析方法，為農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)和安全監(jiān)督提供理論依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)，配熒光檢測(cè)器；R215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，Buchi公司)；T18型高速均質(zhì)儀(德國(guó)，IKA 公司)；固相萃取柱(1 000 mg/6mL)：氨基小柱、弗羅里硅柱和石墨化炭黑柱(美國(guó)，安捷倫公司)。

7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、三羥基克百威、涕滅威、克百威和甲萘威，均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)所，純度99%；鄰苯二甲醛(OPA)、巰基乙醇(Thioflour)、OPA稀釋液(CB910)、0.05 mol/L NaOH溶液(CB130)，均為美國(guó)Pickering公司提供。甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮(色譜純)；NaCl、乙酸乙酯(分析純)。實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ 純水發(fā)生器(美國(guó)Bedford公司)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1衍生試劑的配制稱取100.0 mg衍生試劑OPA，甲醇溶解，放入950 mL OPA 稀釋液中，超聲2.0～5 min。稱取2.0 g巰基乙醇，用少量OPA 稀釋液溶解，混勻到上述OPA稀釋液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2液相色譜條件色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C8柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水，梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.3衍生條件柱后衍生：0.05 mol/L CB130堿液、CB910溶液(OPA)，流速：0.30 mL/min；衍生池溫度：100 ℃；發(fā)射波長(zhǎng)465 nm、激發(fā)波長(zhǎng)330 nm。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別稱取7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各0.0100 g(精確到0.0001 g)，用甲醇分別定容配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.2.5樣品處理東盟水果包括芒果、荔枝、龍眼、香蕉、榴蓮、山竹、菠蘿、火龍果、番荔枝、蛇皮果、紅毛丹、木菠蘿，用四分法[5]取可食部分，粉碎勻漿。稱取25.00 g(精確至0.01 g)樣品放入高型燒杯中，加入50.0 mL提取劑，高速勻漿2 min，過(guò)濾，濾液收集到裝有7.0～8.0 g NaCl的具塞量筒中，劇烈震蕩1～2 min，室溫靜置30 min，分層后準(zhǔn)確吸取10.0 mL提取液到平底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿濃縮至近干，待凈化。

取固相萃取小柱，先用5 mL甲醇-二氯甲烷淋洗液預(yù)淋柱，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附表面時(shí)，加入待凈化溶液，離心管收集洗脫液，用4 mL淋洗液洗脫，重復(fù)3次。水浴上用氮吹儀濃縮至近干，甲醇準(zhǔn)確定容于5.00 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

2.1.1色譜柱選擇對(duì)Agilent Eclipse XDB-C8柱及Agilent Eclipse XDB-C18柱進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，采用Agilent Eclipse XPB-C8色譜柱，7種氨基甲酸酯標(biāo)樣峰形好，其響應(yīng)值、分離度也較好，雜質(zhì)干擾較少，因此選其作為分離柱。

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定對(duì)氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(1.00 mg/L)，參考文獻(xiàn)方法[6，7]中測(cè)定蔬菜、水果中氨基甲酸酯的波長(zhǎng)，同時(shí)經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)試不同組合波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)射波長(zhǎng)465 nm、激發(fā)波長(zhǎng)330 nm時(shí)其峰高、峰面積最佳，經(jīng)測(cè)試其基質(zhì)空白干擾較少，色譜圖較理想，因此選擇該組波長(zhǎng)作為氨基甲酸酯的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3流動(dòng)相的選擇對(duì)氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品及其基質(zhì)空白分別進(jìn)行了甲醇-水、乙腈-水，以及甲醇、乙腈、水3種不同比例的測(cè)試，以確定最佳流動(dòng)相的組合及配比。由實(shí)驗(yàn)可知，甲醇或乙腈或甲醇和乙腈與水無(wú)論以何種比例等度洗脫，都不能很好分離全部目標(biāo)物，分離度差；甲醇或乙腈或甲醇和乙腈與水梯度組合成流動(dòng)相，合適的比例所有的目標(biāo)物都能很好的分離，但乙腈對(duì)人體毒性大。綜合考慮以甲醇與水組成流動(dòng)相，梯度洗脫按表1進(jìn)行，該條件下能夠很好的對(duì)7種氨基甲酸酯進(jìn)行分離，出峰的時(shí)間較理想，在25 min內(nèi)所有的目標(biāo)組分全部洗脫出。7種氨基甲酸酯標(biāo)樣液相色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

圖1 7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標(biāo)樣色譜圖(濃度：0.100 mg/L)

2.2 提取溶劑的選擇

在添加量為0.10 mg/kg 的東盟水果樣品中，分別加入50.0 mL乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯4種提取溶劑進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明乙酸乙酯的提取回收率低，效果較差；二氯甲烷的干擾雜質(zhì)多，峰形不好；丙酮的提取回收率低于乙腈；乙腈的回收率在96.8%～103.5%之間，雜質(zhì)干擾少，效果好。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

2.3.1洗脫小柱的選擇選用石墨化炭黑、弗羅里硅土和氨基小柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明石墨化炭黑能夠很好吸收色素，雜質(zhì)明顯少于其他兩種，但其回收率低，在58.8%～67.9%之間。這可能是吸附力強(qiáng)，部分目標(biāo)化合物吸附后未洗脫出；氨基小柱的凈化效果好，回收率均達(dá)90%以上，雜質(zhì)干擾也較少，弗羅里硅土小柱回收率偏低。因此，選擇氨基萃取小柱為凈化載體。

2.3.2淋洗液比例和用量的選擇分別配制體積比為1∶99、2∶98、5∶95、10∶90和15∶85不同比例的甲醇-二氯甲烷進(jìn)行洗脫試驗(yàn)。綜合考慮回收率和凈化效果，選用甲醇-二氯甲烷(5∶95，V/V)作為洗脫液。用選定的淋洗液洗脫，分段收集并測(cè)定洗脫液中目標(biāo)物的含量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定淋洗體積為10 mL，以2 mL、4 mL和4 mL分3次洗脫。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及檢出限的確定

按1.2.4條件配制 7種氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在選定條件下測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析，檢出限按信噪比(S/N)=3計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的保留時(shí)間、回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(R2)和檢出限

2.5 添加回收率與精密度

向芒果、荔枝和龍眼樣品中添加7種氨基甲酸酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察方法的準(zhǔn)確度和精確度。結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度為0.10～0.50 mg/kg時(shí)，7種氨基甲酸酯三個(gè)濃度水平的平均添加回收率在80.7%～107.7%之間，變異系數(shù)在0.5%～8.8%之間，說(shuō)明該方法完全符合農(nóng)藥殘留分析的要求[8]。

2.6 東盟水果樣品檢測(cè)

對(duì)南寧市、崇左市部分批發(fā)市場(chǎng)及超市的100個(gè)東盟水果樣品進(jìn)行了7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，均未檢出此類農(nóng)藥，表明該類農(nóng)藥目前在東盟水果中控制較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-柱后衍生法同時(shí)測(cè)定東盟水果中7種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。方法具有操作簡(jiǎn)便、凈化及分離效果好、價(jià)格低廉、定性及定量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合東盟水果中氨基甲酸酯的殘留分析。