劉慧青， 李愛梅， 徐中其

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

手性是自然界很多化合物具有的普遍特性。臨床上常用的藥物中高達(dá)62%是手性藥物，大多以外消旋體形式供藥。通常來說，手性藥物的對映異構(gòu)體在人體內(nèi)大多情況下會(huì)表現(xiàn)出不同的療效和毒理性，對映體之一具有活性和治療性，另外一個(gè)則是非活性，甚至具有毒副作用[1]。因此，拆分并測定手性藥物異構(gòu)體成為臨床學(xué)和生命科學(xué)中的一個(gè)重要問題。常見的藥物手性拆分方法有經(jīng)典結(jié)晶法、動(dòng)力學(xué)拆分法和色譜分離法等。近年來色譜分離法已成為藥物分析檢驗(yàn)中應(yīng)用極為廣泛的拆分方法[2,3]，但存在費(fèi)用昂貴和分析時(shí)間長等缺點(diǎn)。毛細(xì)管電泳(CE)直接拆分手性對映體，憑借其分離效率高、分析時(shí)間短、溶劑消耗少、方法靈活和僅需微量樣品等優(yōu)點(diǎn)得到迅速發(fā)展，被日益廣泛的應(yīng)用于手性藥物拆分領(lǐng)域[4 - 6]。

圖1 CIT兩對映體的結(jié)構(gòu)式

選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)是一類抗抑郁藥的總稱，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、強(qiáng)迫癥及神經(jīng)性厭食癥。西酞普蘭(Citalopram，CIT)是SSRI的一種(結(jié)構(gòu)式見圖1)，其對5-HT再吸收抑制作用強(qiáng)、選擇性高[7]。CIT以消旋體化合物的形式存在，藥理學(xué)研究證實(shí)，CIT的(S)-對映體依他普侖(Escitalopram)是消旋體CIT產(chǎn)生5-HT再攝取抑制作用的原因，依他普侖在體內(nèi)對5-HT再攝取的抑制作用是(R)-CIT的167倍。單一對映體形式的依他普侖已上市，因此，開發(fā)高靈敏的手性分析方法具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，CIT的CE手性拆分方法中使用的拆分試劑主要是糖類物質(zhì)，特別是環(huán)糊精及其衍生物[8,9]。Mandrioli等以1%(m/V)磺化β-環(huán)糊精和0.05%(m/V)β-環(huán)糊精為手性拆分劑，應(yīng)用CE技術(shù)開發(fā)了CIT手性拆分方法，6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)手性分離，檢測限0.15 μg/mL[10]。Sungthong等將0.5 mg/mLβ-環(huán)糊精和22 mg/mL磺化β-環(huán)糊精添加到緩沖液中，應(yīng)用CE技術(shù)開發(fā)了檢測(S)-CIT中雜質(zhì)組分((R)-CIT、(R)-Citadiol、(S)-Citadiol)的方法，各雜質(zhì)的定量限均為2.5 μg/mL[11]。本文采用磺化β-環(huán)糊精為手性選擇劑，對CIT光學(xué)異構(gòu)對映體S-CIT和R-CIT進(jìn)行CE法拆分，考察了各實(shí)驗(yàn)條件對拆分效果的影響，并初步探討了手性試劑羥乙基β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和磺化β-環(huán)糊精的拆分機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckman)。

CIT消旋體購自上海麥倉生物科技有限公司；來士普成品藥((S)-CIT·HBr)購自倫貝克公司(丹麥哥本哈根)。β-環(huán)糊精(β-CD)、甲基β-環(huán)糊精(M-β-CD)、羥乙基β-環(huán)糊精(HE-β-CD)、羧甲基β-環(huán)糊精(CM-β-CD)和磺化β-環(huán)糊精(S-β-CD)，均購自Sigma-Aldrich；檸檬酸、H3PO4、NaH2PO4和Na2PO4、NaOH，均購自中國國藥集團(tuán)。試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液的配制

儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的消旋體西酞普蘭，用超純水定容，配成0.20 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液置于冰箱中保存，每次使用之前用超純水稀釋到相應(yīng)的濃度。緩沖溶液：配制檸檬酸緩沖溶液，按照需要加入不同量的檸檬酸和手性拆分劑，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，最后定容。樣品溶液：取2粒依他普侖藥片(來士普，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格為10 mg(S)-CIT·HBr/tablet)，稱重為0.2590 g，將藥片用研缽研碎，稱取0.1208 g依他普侖用約60 mL超純水溶解，超聲10 min，定容至100 mL。12 000 r/min離心10 min后，取上清液過濾后，備用(其中(S)-CIT·HBr的含量為100.0 μg/mL)。

1.3 毛細(xì)管電泳操作條件

彈性石英毛細(xì)管柱總長度為50 cm，其有效長度40 cm，內(nèi)徑為75 μm(河北永年銳灃色譜器件有限公司)。毛細(xì)管首次使用時(shí)依次用甲醇沖洗10 min，超純水沖洗5 min，1 mol/L NaOH溶液沖洗30 min，超純水沖洗5 min。每次實(shí)驗(yàn)前依次用超純水沖洗3 min，緩沖溶液沖洗3 min，再進(jìn)行樣品的分離。

檢測條件：樣品濃度為10 μg/mL，采用0.5 psi持續(xù)5 s進(jìn)樣，分離電壓+20 kV。毛細(xì)管溫度采用液冷方式控制在25 ℃，紫外檢測波長設(shè)定為205 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液的選擇本實(shí)驗(yàn)在固定手性拆分劑S-β-CD為0.04%(m/V)的條件下，研究了檸檬酸、Na2HPO4-H3PO4和Tris-H3PO4緩沖溶液對CIT的兩個(gè)對映體分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸緩沖體系中，遷移時(shí)間較快，且有較好的分離度和峰形，分離效果較理想。選擇檸檬酸體系作為緩沖溶液。

2.1.2緩沖溶液pH值的選擇毛細(xì)管電泳中緩沖溶液pH值是非常重要的參數(shù)之一。本實(shí)驗(yàn)考察了pH=4～7范圍內(nèi)，CIT對映體分離的變化，結(jié)果見圖2。分離度(RS)隨著pH的減小而增大，這可能是pH減小使得毛細(xì)管中的電滲流淌度降低，從而延長對映體與手性拆分劑在毛細(xì)管內(nèi)的作用時(shí)間，最終提高對映體的RS。但是當(dāng)pH小于5.50時(shí)，緩沖能力急劇降低且分析時(shí)間延長。考慮到pH為5.50時(shí)已有足夠的RS，最終確定檸檬酸緩沖溶液的pH值為5.50。

2.1.3緩沖溶液濃度的選擇實(shí)驗(yàn)固定pH=5.50和手性拆分劑S-β-CD為0.04%，考察了檸檬酸緩沖溶液濃度在10～50 mmol/L范圍內(nèi)變化對分離效果的影響(圖3)。結(jié)果表明，增大緩沖溶液濃度會(huì)使毛細(xì)管電滲流下降，但同時(shí)CIT有效淌度增大且RS降低，因此應(yīng)盡量選擇較低的濃度?？紤]到檸檬酸濃度為10 mmol/L時(shí)緩沖能力較差，最終優(yōu)化的緩沖溶液濃度為20 mmol/L。隨檸檬酸濃度的增大，CIT有效淌度增大而兩個(gè)對映體的分離度降低。其原因可能是CIT兩個(gè)對映體和拆分劑動(dòng)態(tài)結(jié)合后的兩非對映體與檸檬酸發(fā)生了相互作用，增大檸檬酸濃度使非對映體有效淌度增大并減小了兩種非對映體的差異，從而導(dǎo)致其RS降低。

2.1.4手性拆分劑的選擇實(shí)驗(yàn)考察了不同手性試劑對CIT兩對映體電泳分離的影響。分別采用環(huán)糊精衍生物(S-β-CD、M-β-CD、H-β-CD、HE-β-CD和CM-β-CD)、膽酸鹽(膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、去氫膽酸鈉、牛磺膽酸鈉)和糖肽類抗生素(萬古霉素、替考拉寧)作為手性拆分劑，改變拆分劑的濃度和緩沖溶液pH值，結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)表明：四種膽酸鹽和兩種抗生素對CIT沒有拆分能力；只有部分環(huán)糊精衍生物對CIT具有手性拆分能力，其中拆分能力順序?yàn)椋篠-β-CD>HE-β-CD>H-β-CD。這很可能是由于HE-β-CD的側(cè)鏈長度大于H-β-CD，具有調(diào)節(jié)性更好的空腔，因此拆分能力更大；S-β-CD由于共軛作用的影響，使O具有更強(qiáng)的電負(fù)性，因此與雜原子形成的氫鍵更強(qiáng)；且CIT的呋喃環(huán)是剛性結(jié)構(gòu)，因此O、F、N的位置相對固定，能和S-β-CD形成更強(qiáng)的氫鍵相互作用，進(jìn)而S-β-CD表現(xiàn)出很強(qiáng)的手性拆分能力[12,13]。因此，選擇S-β-CD作為手性拆分劑。

圖2 pH值對手性拆分效果的影響

圖3 緩沖溶液濃度對手性拆分效果的影響

2.1.5手性拆分劑濃度的選擇手性藥物分離中，一般手性拆分劑的濃度越大拆分效果越好，即RS越大。本實(shí)驗(yàn)在緩沖溶液中添加0.005%～0.1%(m/V)的S-β-CD，考察了拆分劑濃度對CIT手性分離的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)緩沖溶液中S-β-CD濃度由0.005%增大到0.04%時(shí)，CIT的兩個(gè)對映體分離度逐漸變大；當(dāng)S-β-CD濃度繼續(xù)增大至0.01%時(shí)，(S)-CIT和(R)-CIT分別在電滲流(EOF)前后出峰。這是因?yàn)镃IT的pKa約為9.5，在pH=5.50的檸檬酸緩沖溶液中呈陽離子；而S-β-CD在該檸檬酸緩沖溶液中呈陰離子，兩者在電場中移動(dòng)方向相反。因此CIT的兩個(gè)對映體與拆分劑S-β-CD動(dòng)態(tài)結(jié)合后，使其有效淌度變小甚至反向。由于兩個(gè)對映體與拆分劑的平衡常數(shù)不同，當(dāng)手性拆分劑濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)，使得兩個(gè)對映體與拆分劑S-β-CD動(dòng)態(tài)結(jié)合后整體分別帶相反電荷，并在EOF兩側(cè)出峰。綜合考慮以上因素，本實(shí)驗(yàn)選擇拆分劑濃度為0.04%，在此條件下CIT的兩對映體可以獲得較好的分離度。

圖4 手性拆分劑對手性拆分效果的影響

圖5 S-β -CD濃度對手性拆分效果的影響

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1方法的重現(xiàn)性和檢出限在優(yōu)化后的檢測條件下，將CIT兩個(gè)對映體連續(xù)5次進(jìn)樣，考察方法的重現(xiàn)性和選擇性。(S)-CIT和(R)-CIT遷移時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.8%、1.6%，峰面積的RSD分別為2.2%、2.9%；分離度(RS)為8.62。以信噪比(S/N)=10計(jì)算出兩個(gè)對映體的定量限(LOQ)均為0.3 mg/L，以S/N=3計(jì)算檢出限(LOD)均為90 μg/L。

2.2.2方法的線性關(guān)系用對映體濃度分別為0.050、0.10、0.25、0.50、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化后電泳條件下，對每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣兩次，結(jié)果表明兩個(gè)對映體濃度在0.05～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程分別為：(S)-CIT：Y=31.62X+12.92，R2=0.999；(R)-CIT：Y=32.24X+17.78，R2=0.998。

2.3 來士普藥片的分析

2.3.1對映體的定性及光學(xué)純度的測定通過向20 μg/mL消旋體CIT中添加0～50 μg/mL不同濃度的(S)-CIT，在優(yōu)化檢測條件下對該系列樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖6所示，隨(S)-CIT濃度的增加，第一個(gè)峰逐漸增大，表明遷移時(shí)間短的是(S)-CIT，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

以依他普侖藥片經(jīng)處理后的溶液(按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格計(jì)算，(S)-CIT·HBr為100 μg/mL)為樣品，對該樣品進(jìn)行分離測定(圖7)。結(jié)果表明，藥品中(R)-CIT的含量為總量的1.27%，對映體過剩百分?jǐn)?shù)為97.5%，符合要求。

圖6 對映異構(gòu)體的定性

圖7 藥品光學(xué)純度的測定

2.3.2含藥量和回收率將處理好的樣品(100 μg/mL(S)-CIT·HBr)稀釋10倍，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下對該樣品進(jìn)行分析(重復(fù)3次)，并通過標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算出濃度，最后計(jì)算實(shí)際含藥量為標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格。繼而向該稀釋樣品中添加20.0 μg/mL CIT(重復(fù)3次)，測定兩個(gè)對映異構(gòu)體的回收率，結(jié)果見表1。

表1 來士普成品藥中的含藥量及回收率(n=3)

"ND":not detected.

3 結(jié)論

以S-β-CD作為手性選擇劑對西酞普蘭對映體進(jìn)行毛細(xì)管電泳拆分，通過對分離條件的優(yōu)化，建立了具有分析時(shí)間短、重現(xiàn)性好和靈敏度高等特點(diǎn)的毛細(xì)管電泳拆分方法。該方法減少了拆分劑磺化β-CD的使用濃度，具備了更加靈敏的定量檢測能力，更加適合于西酞普蘭對映體的拆分分析。