曾議霆，郭溪浪，周 康*，劉書亮，韓新鋒

（四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

富硒乳酸菌的篩選及鑒定

曾議霆，郭溪浪，周 康*，劉書亮，韓新鋒

（四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

對5 種15 株乳酸菌的生長曲線進行了測定，并對亞硒酸鈉添加質量濃度、耐硒和富硒能力進行比較，篩選出了富硒優(yōu)勢乳酸菌，并進行了生理生化和分子鑒定。結果表明：適宜的加硒時間為培養(yǎng)后的第6小時，培養(yǎng)時間為24 h。通過對9 株菌株比較，確定了較適宜的亞硒酸鈉添加質量濃度為6 μg/mL。最終篩選出BC-25為富硒優(yōu)勢菌株，富硒量425.79 μg/g，硒轉化率達27.00%，經16S rDNA分析鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）。

乳酸菌；富硒；篩選；鑒定

硒是人體14大微量元素之一，已被聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）/國際原子能組織（International Atomic Energy Agency，IAEA）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）共同確認為人體必需的一種重要微量元素，與機體正常生理功能的維持以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［1-2］，是哺乳動物體內許多酶活性中心的必需組分，如谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）［3］、脫碘酶（iodothyronine deiodinases，ID）［4］等，具有保護細胞膜的結構和功能免受過度氧化損傷，抗癌、解毒、保肝和提高人體免疫力的生理功能［5-6］。據統(tǒng)計我國有2/3的人口居住在低硒或缺硒的地區(qū)，約有3億 人處于缺硒狀態(tài)，日常食用的食物中硒含量普遍較低，一般不足0.01 ?g/g，很難滿足國際學術組織聯(lián)合會建議的成年男女膳食硒適宜需要量分別為40 ?g/d和30 ?g/d的要求［7］。因而人工補硒方法已受到國內外有關專家的廣泛關注。時至今日，一般補硒的方法仍是用無機硒化合物制成口服制劑，無機硒即亞硒酸鈉，但亞硒酸鈉具有較強的毒副作用，研究顯示，無機硒經生物轉化后的有機硒化合物毒性低且在激發(fā)免疫反應上比無機硒顯著［8］，且吸收率更高，這對于我國推廣并用以改善硒缺乏的狀態(tài)有極大的意義。

由于人工合成有機硒技術難度大，成本高，因而不少學者對利用動植物的吸收、轉化作用獲取有機硒進行了研究［9-11］。富硒常用的載體多為植物類食品［12］，富硒肉類食品［13-14］也有相關研究，而在以微生物作為載體研究最多的就是酵母菌［15］，隨著生物化學技術的不斷發(fā)展，目前，作為益生菌——乳酸菌，其保健功能、良好的風味和可靠的安全性已經被廣大消費者所認可［16］，作為有機硒的一個新型來源，其生物學效應和 潛在開發(fā)應用前景非常廣闊。本實驗旨在篩選出一株具有富硒優(yōu)勢的乳酸菌，并對其進行生理生化和分子鑒定，為今后關于乳酸菌富硒的進一步研究和應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

15 株乳酸菌，編號分別為：2.10、K、M、F、U、Dx、SJ-01、L- N3、LB-12、JT-03、BC-12、BC-13、BC-23、BC-25、BC-32，由四川農業(yè)大學微生物實驗室提供。

1.1.2培養(yǎng)基

改良MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、K2HPO4·3H2O 1.52 g、醋酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.19 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2，分裝后121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3試劑與儀器

亞硒酸鈉（分析純）、硝酸、高氯酸、5 g/100 mL乙二胺四乙酸二鈉鹽（ethylenediamine teraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）等均為優(yōu)級純。

SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州智凈凈化設備有限公司；SHP-250恒溫培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；DL-5000B-II冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DK-S28電熱恒溫水浴鍋、DZF-6050電熱真空干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；ESJ210-4A電子精密天平 沈陽龍騰電子有限公司；Carry60紫外-可見分光光度計 安捷倫科技有限公司；T100型梯度PCR儀、580BR 3755熒光定量PCR儀、Dio-Gel-2000凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1菌種活化

為了提高菌種的活力，將各菌株接種于液體MRS培養(yǎng)基中，36 ℃適宜條件下培養(yǎng)18 h，并連續(xù)活化培養(yǎng)3 代，用生理鹽水稀釋，調整OD600nm為0.60，即得到種子液，備用。

1.2.2菌種的生化鑒定

挑取典型菌落進行糖發(fā)酵試驗，參考GB 4789.35—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》、《伯杰細菌鑒定手冊》、《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》，初步鑒定乳酸菌的屬種［17-19］。

1.2.3乳酸菌生長曲線測定

通過測定乳酸菌生長曲線，確定適宜的加硒時間和培養(yǎng)時間。種子液以5%的接種量接入到改良MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量150 mL/250 mL三角瓶（以下接種相同）［20］，36 ℃靜止培養(yǎng)。每隔2 h取出，采用比濁法，測定乳酸菌菌液的OD600nm值，繪制生長曲線。

1.2.4適宜硒質量濃度的選擇

根據生化鑒定結果，每種菌屬選出一些菌株，接種于含不同亞硒酸鈉質量濃度（0、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL）的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心10 min，觀察菌體顏色變化，確定最適加硒質量濃度［21］。

1.2.5耐硒能力測定

測定所有株菌在適宜無機硒質量濃度下的生物量，每株菌兩個平行，同時做空白對照實驗，選出耐硒能力較強的菌株，-20 ℃保藏備用。

1.2.6富硒能力實驗

將選出的耐硒能力較強的菌株接種于含適宜硒濃度的改良MRS液體培養(yǎng)基中，每組做兩個平行，同時做空白對照實驗，36 ℃適宜條件下富硒培養(yǎng)。收集菌體培養(yǎng)物，測富硒量和硒轉化率，選出一株富硒能力強的乳酸菌，-20 ℃保藏備用。

1.2.7乳酸菌生物量的測定

將菌體培養(yǎng)物于65 ℃烘干至恒質量，計算每100 mL培養(yǎng)基菌體干質量。

1.2.8菌體培養(yǎng)物制備

菌體培養(yǎng)物以5 000 r/min離心10 min，傾去上清液，加入30 mL雙重蒸餾水，混合均勻后離心（5 000 r/min，10 min），傾去上清液。如此反復洗滌3 次，將附著于細胞表面的硒洗去。最后5 000 r/min離心20 min獲得最終菌體培養(yǎng)物，65 ℃烘干，密封保存。

1.2.9硒含量測定

采用DAB分光光度法檢測硒含量［22］。

1.2.9.1標準曲線繪制

準確吸取10 μg/mL的硒標準溶液0、2、4、6、8、10 mL分別加到100 mL的燒杯中，加水至35 mL，再加入5 g/100 mL EDTA-2Na溶液1 mL，搖勻，并用1：1的鹽酸調節(jié)pH值至2～3，各加0.5% DAB溶液4 mL，搖勻，置于暗處30 min，再用5% NaOH調節(jié)pH值至中性，加入到分液漏斗中，加入10 mL甲苯振搖2 min，靜置分層，去水層，收集甲苯層于比色皿中，于420 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線［23］。

1.2.9.2菌體培養(yǎng)物中硒的測定

稱取約0.1 g干菌體樣品于帶刻度具玻璃塞10 mL 試管中，加入混合酸消化液（硝酸-高氯酸（5：1，V/V））0.6 mL，放置過夜。然后將試管置于100 ℃水浴鍋中加熱4 h。當試管內黃褐色氣體排盡后，取出試管放冷卻，加入30%過氧化氫溶液2 mL，繼續(xù)置于沸水浴中消化，至消化液呈現(xiàn)無色或淡黃色即達終點。取出試管放冷卻后，以超純水定容至10 mL，待上機測定。同時作空白對照［24］。

1.2.9.3培養(yǎng)上清液中殘留硒含量測定

取20 mL上清液，加水至35 mL，加入2 mL 5 g/100 mL EDTA-2Na溶液，以下同標準曲線制定步驟［25］。同時作空白對照。

1.2.10乳酸菌菌株16S rDNA分析

采用細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）試劑盒提取菌株的DNA；向各無菌EP管中依次加入9.5 μL超純水、12.5 μL 2×PCR Master Mix、上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，瞬離后置于熒光定量PCR儀中，于如下PCR擴增條件中擴增：94 ℃預變性5 min，一次循環(huán)；94 ℃變性1 min，65 ℃復性1 min，72 ℃延伸20 s，經30 個循環(huán)后，72 ℃繼續(xù)延伸10 min，一次循環(huán)；擴增后的DNA在1%瓊脂糖凝膠板上于80 V電泳50 min，再凝膠成像；將DNA送檢測序，通過BLAST方法比對，鑒定出所得菌株。

2　結果與分析

2.1生化鑒定結果

通過19 種糖發(fā)酵管鑒定出15 種菌的種屬，結果見表1。

表1　生化鑒定結果Table1 Biochemical identification resultss

圖1　乳酸菌生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria （LAB）

2.2加硒時間和培養(yǎng)時間的確定

15 株乳酸菌的生長曲線如圖1所示，在培養(yǎng)6 h后，菌的生長開始進入對數(shù)期，24 h后，部分菌開始降解。由于加硒時間越早，對菌生長的抑制作用越強，在對數(shù)期菌的生長代謝旺盛，轉化率高。Suhajda等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在酵母細胞對數(shù)生長期前期添加無機硒，所得酵母的含硒量最高，并隨著對數(shù)期細胞增殖，富硒能力增強，以后隨穩(wěn)定期接近而逐漸減弱。靳志強等［27］研究也發(fā)現(xiàn)，在對數(shù)生長初期加入亞硒酸鈉可以得到菌體硒含量和細胞硒轉化率均最大的結果。因此從轉化率和生長周期考慮，選擇乳酸菌進入對數(shù)生長初期時加入無機硒，即培養(yǎng)6 h后加入亞硒酸鈉溶液，培養(yǎng)24 h。

2.3適宜硒質量濃度的確定

根據表1的生化鑒定結果，每個種屬乳酸菌選擇一些進行不同硒質量濃度的富硒實驗，植物乳桿菌：M、BC-23、L-N3、BC-25，干酪乳桿菌：U、BC-12，干酪乳桿菌假植物亞種：2.10，嗜酸乳桿菌：BC-13，木糖乳桿菌：BC-32，共9 株菌。不同菌株在不同亞硒酸鈉質量濃度下的菌體顏色變化見表2。

表2　9 株菌在不同亞硒酸鈉質量濃度下培養(yǎng)24 h后的菌體顏色變化情況Table2 Color changes of 9 strains cultured at different concentrations of sodium selenite for 24 h

由表2可知，在所設定的亞硒酸鈉質量濃度范圍內，菌體顏色變紅的程度與亞硒酸鈉質量濃度呈正相關，說明亞硒酸鈉質量濃度越高，轉變成為單質硒的量越多［28］。質量濃度低于6 μg/mL時菌體顏色正常，6 μg/mL時菌體顏色變紅不明顯，為了使更多的無機硒進入細胞轉化成有機硒，較少單質硒的轉化。因此，以6 μg/mL作為加硒質量濃度。

2.4耐硒篩選結果

同屬不同種細菌對無機硒的耐受能力不同［25］，耐硒能力大小可以用多種指標反映，如細菌光密度（OD600nm）值［29］、透明圈大小、紅硒現(xiàn)象出現(xiàn)所對應的無機硒質量濃度［30］、生物量［31］等。本實驗通過比較相同無機硒質量濃度下生物量變化大小，以篩選出耐硒能力較強的菌株。15 株菌在6 μg/mL亞硒酸鈉質量濃度下富硒培養(yǎng)后，各株菌的生物量測定結果如表3所示。

表3　15株菌在6μg/mL亞硒酸鈉質量濃度下培養(yǎng)后的生物量測定結果Table3 Biomasses of 15 strains cultured with 6μg/mL sodium selenite

比較加硒與未加硒乳酸菌生物量的變化（表3）發(fā)現(xiàn)，加了6 μg/mL亞硒酸鈉后，除BC-25、BC-13、BC-32生物量有增加外，其他12 株菌的生物量均有不同程度的降低，說明6 μg/mL亞硒酸鈉的添加能抑制大多數(shù)菌的生長，而促進BC-25、BC-13、BC-32的生長。生物量增加順序為：BC-25＞BC-13＞BC-32，BC-25和BC-13明顯高于BC-32，說明BC-25和BC-13存活的總菌數(shù)大于BC-32，因此，確定BC-25、BC-13兩株菌株均具有相對較強的耐硒能力。

2.5富硒能力測定結果

表4　分光光度法測硒含量結果Table4 Sodium selenite concentration in cultured cells and supernatants as determined spectrometrically by spectrophotometer

由表4可知，未加硒的空白上清液中測出的硒含量也較高，可能是培養(yǎng)基的色素被有機溶劑提取出來了，干擾了測定結果，使對照組測定結果較高，因此以菌體培養(yǎng)物中硒含量測定來分析硒轉換率。

由菌體中硒含量測定結果可知，富硒量和硒轉化率都一樣BC-25＞BC-13，因此確定BC-25具有相對較強富硒能力。關于富硒能力研究，Calomme等［32］通過對3 株乳酸菌進行富硒培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，添加硒（Ⅳ）質量濃度為1 mg/L時，3 株菌的硒含量分別為（253±50）、（375±33）、（407±108） μg/g，本實驗篩選出的BC-25富硒量425.79 μg/g，說明BC-25具有較好富硒性能。

2.6BC-25的16S rDNA分析結果

圖2　BC-25的16S rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR-amplified 16S rDNA of BC-25

表5　菌株BC-25的BLAST同源性比較結果Table5 Homology between BC-25 and other strains by BLAST analysis

由系統(tǒng)發(fā)育樹和對比結果（表5）可知，被測菌株BC-25與Lactobacillus plantarum WCFS1的匹配一致性達到99%，同時結合生化鑒定結果來看，可以確定被測菌株BC-25即為一株植物乳桿菌。

3　結 論

本實驗通過對15 株菌生長曲線測定，確定適宜的加硒時間為培養(yǎng)后的第6小時，培養(yǎng)時間為24 h；通過適宜硒質量濃度選擇，確定適宜的亞硒酸鈉添加質量濃度為6 μg/mL；根據耐硒能力、富硒能力及硒含量測定，選出BC-25為富硒優(yōu)勢菌株，富硒量為425.79 μg/g，硒轉化率為27.00%，具有相對較強的富硒能力。16S rDNA序列分析鑒定結果確定BC-25為Lactobacillus plantarum。本研究為在益生菌中尋找富硒載體提供了一定依據，但是本實驗篩選出的乳酸菌富硒能力還有待提高，為了進一步提高它的耐硒富硒能力，可以考慮對其進行更多富硒條件優(yōu)化，如耐硒馴化、紫外誘變等。

［1］ 侯小東， 藺新英. 硒等微量元素的生物學相關效應的研究進展［J］.環(huán)境與健康雜志， 2007（10）: 840-841.

［2］ 蔡東聯(lián)， 耿珊珊. 硒的生理功用與疾病防治［J］. 微量元素與健康研究， 2006（2）: 58-61.

［3］ ROTRUCK J T， POPE A L， GANTHER H E， et al. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase［J］. Science，1973， 179（73）: 588-590.

［4］ BERRY M J， BAN U L， LARSEN P R. Type Ⅰ iodothyronine deiodinase is a selenocysteine-containing enzyme［J］. Nature， 1991，349: 438-440.

［5］ 熊華偉， 簡少卿， 賈小芳， 等. 富硒酵母對斑點叉尾肝臟的毒性作用及蛋白質組學的影響［J］. 水產學報， 2011， 35（7）: 1008-1014.

［6］ 朱善良， 陳龍. 乳酸菌源有機硒對肝損傷小鼠組織脂質過氧化的保護作用［J］. 江蘇教育學院學報， 2012， 26（12）: 38-40.

［7］ 楊光圻， 顧履珍. 微量元素硒的人體需要量和安全攝入量范圍［J］.生理科學進展， 1992（2）: 184-186.

［8］ RAYMAN M P. The importance of selenium to human health［J］. The Lancet， 2000， 356: 233-241.

［9］ 歐陽培， 童斌. 富硒蚯蚓含硒蛋白研究［J］. 廈門大學學報: 自然科學版， 1993， 32（6）: 795-798.

［10］ 蔣立科， 巴宇青， 詹萬貴. 蜜蜂合成有機硒對釀蜜的影響［J］. 食品科學， 1994， 15（7）: 45-48.

［11］ GENNITY J M， BOTTINO N R， ZINGARO R A， et al. A seleniumin duced peroxidation of glutathione in algae［J］. Phytochemistry， 1985，24（12）: 2817-2821.

［12］ PYRZYNSKA K. Selenium speciation in enriched vegetables［J］. Food Chemistry， 2009， 114: 1183-1191.

［13］ 王燕燕， 吳森， 陳福財， 等. 補硒對肉羊血硒水平、產肉性能和肉品質的影響［J］. 家畜生態(tài)學報， 2013， 34（6）: 21-25.

［14］ 王曉龍， 朱東澤， 魏營， 等. 富硒酵母和亞硒酸鈉對肉仔雞生長后期日增重影響的Meta分析［J］. 生物數(shù)學學報， 2009， 24（3）: 551-555.

［15］ P?REZ-CORONAA M T， S?NCHEZ-MART?NEZA M，VALDERRAMA M J， et al. Selenium biotransformation by Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus during white wine manufacture: laboratory-scale experiments［J］. Food Chemistry，2011， 124: 1050-1055.

［16］ 駱承庠. 乳與乳制品工藝學［M］. 北京: 中國農業(yè)出版社， 2003.

［17］ GB 4789.35—2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗［S］.

［18］ 布坎南R E， 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊［M］. 8版. 北京: 科學出版社， 1984: 814-815.

［19］ 凌代文， 東秀珠. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法［M］. 北京: 中國輕工業(yè)出版社， 1999: 85-86.

［20］ 黃秀錦. 富硒乳酸菌發(fā)酵條件的研究［J］. 中國調味品， 2009， 34（12）: 54-60.

［21］ 宋照軍， 王樹林， 潘潤淑， 等. 富硒乳酸菌的分離、篩選、馴化及富硒研究［J］. 中國釀造， 2004， 23（11）: 4-6.

［22］ XIA Shukai， CHEN Long， LIANG Junqing. Enriched seleniumand its effects on growth and biochemical composition in Lactobacillus bulgaricus［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007，55（6）: 2413-2417.

［23］ 賈姍姍， 朱連勤， 朱風華， 等. 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法檢測硒［J］.畜牧與獸醫(yī)， 2012， 44（6）: 74-76.

［24］ 楊保收， 陳越， 金久善， 等. 水浴濕法消化Zeem an石墨爐原子吸收法測定肉雞肝組織中硒含量［J］. 中國獸醫(yī)學報， 2000， 20（1）: 55-57.

［25］ 黃高明. 富硒乳酸菌種的篩選［J］. 廣州食品工業(yè)科技， 2004， 20（4）: 33-35.

［26］ SUHAJDA A， HEGO C J， JANZS O B， et al. Preparation of selenium yeasts Ⅰ. Preparation of selenium-enriched Saccharomy cescerevisiae［J］. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2000， 14（1）: 43-47.

［27］ 靳志強， 張博文， 李平蘭， 等. 動物雙歧桿菌01耐硒性能及富硒條件的研究［J］. 食品科學， 2009， 30（15）: 184-187.

［28］ 劉紅芳， 鄧澤元， 徐靚， 等. 乳酸菌LA4還原亞硒酸鈉形成紅色單質硒［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2013， 39（7）: 69-73.

［29］ 余善鳴， 孫強， 徐偉， 等. 乳酸菌耐硒能力的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技，2005， 21（4）: 17-18.

［30］ 朱何東， 常峰， 羅俊成， 等. 富硒乳酸菌的篩選及其富硒能力的初步研究［J］. 釀酒科技， 2005（8）: 29-31.

［31］ 靳志強. 富硒雙歧桿菌中硒的賦存形態(tài)及分布［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2010， 36（1）: 25-28.

［32］ CALOMME M R， van den BRANDE N K， van den BERGHE D A. Selenium and Lactobacillius species［J］. Journal of Applied Bacteriology， 1995， 79: 331-340.

Screening and Identification of Se-Enriching Lactic Acid Bacteria

ZENG Yiting， GUO Xilang， ZHOU Kang*， LIU Shuliang， HAN Xinfeng
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China）

A total of 15 lactic acid bacteria derived from 5 species were studied by comparing their growth curves and abilities to tolerate and enrich Se. We also identified and characterized the selected strain by biochemical and molecular biological methods. The results showed that the optimum time to add Se was at the end of 6-hour culture period after which the culture was carried out for another 18 hours. The optimum sodium selenite concentration for Se enrichment was found to be 6 μg/mL by comparing 9 selected strains. The strain BC-25 was eventually selected as the best Se-enriching strain， which could enrich 425.79 μg/g of Se with a transformation rate of 27.00%. The 16S rDNA sequence results indicated that BC-25 is Lactobacillus plantarum.

lactic acid bacteria； Se enrichment； screening； identification

TS254

A

1002-6630（2015）03-0178-05

10.7506/spkx1002-6630-201503034

2014-10-09

曾議霆（1990—），女，碩士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：1032401816@qq.com

周康（1983—），男，副教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：kang_zhou@163.com