王建榮，劉丹妮，李 鵬，李陽(yáng)源

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

克氏擔(dān)孢酵母脂肪酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)

王建榮，劉丹妮，李 鵬，李陽(yáng)源*

（廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東 珠海 519060）

以克氏擔(dān)孢酵母V3脂肪酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建畢赤酵母穩(wěn)定的高效表達(dá)系統(tǒng)。采用同源克隆法從克氏擔(dān)孢酵母V3中獲得一個(gè)脂肪酶基因，并將其構(gòu)建到表達(dá)載體pPICZαA，轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33中，成功實(shí)現(xiàn)了克氏擔(dān)孢酵母V3脂肪酶基因在畢赤酵母X33中的表達(dá)。重組工程菌搖瓶培養(yǎng)120 h后，酶活力可達(dá)18 U/mL。重組酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適pH值為5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的曲通-100、吐溫-80、吐溫-20對(duì)重組KLIP具有激活作用。重組酶的最適底物為三硬脂酸甘油酯（C18）。

克氏擔(dān)孢酵母；脂肪酶；畢赤酵母

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3）是一種可以在油水界面上催化天然底物油脂水解釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油以及脂肪酸，而在非水相體系中脂肪酶還可催化轉(zhuǎn)酯和酯合成等多種反應(yīng)［1-3］。由于脂肪酶這種特殊的酶學(xué)特性，使其在食品加工、油脂改性、洗滌、能源等眾多工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力［4-7］。

脂肪酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑其主要來(lái)源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有較廣的作用pH值、作用溫度范圍以及底物專一性；微生物分泌的脂肪酶一般都為胞外酶，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)［8-10］。隨著對(duì)脂肪酶研究的深入，越來(lái)越多的微生物脂肪酶被挖掘出來(lái)。微生物脂肪酶主要分為細(xì)菌脂肪酶和真菌脂肪酶兩大類，細(xì)菌脂肪酶研究較多的是假單胞菌屬脂肪酶［11］，真菌脂肪酶的研究主要集中在根霉屬和酵母屬兩大類［12-13］。迄今，酵母屬脂肪酶的研究主要集中在3 類脂肪酶，分別是褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL），南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B，CALB）以及解酯耶式酵母脂肪酶2（Yarrowia lipolytica lipase 2，YLLip2）［14-16］。隨著酶催化技術(shù)的不斷推廣應(yīng)用，酶應(yīng)用的條件也越來(lái)越嚴(yán)格，如高溫、高壓等特殊條件。CRL、CALB以及YLLip2的熱穩(wěn)定性差，在高溫條件下很容易變性失活。相對(duì)于CRL、CALB以及YLLip2，來(lái)源于克氏擔(dān)孢酵母的脂肪酶（Kurtzmanomyces lipase，KLIP）則具有很好的熱穩(wěn)定性［17］。KLIP良好的熱穩(wěn)定性使其在一些極端的反應(yīng)條件下（如高溫）具有很好的應(yīng)用潛力。

克氏擔(dān)孢酵母表達(dá)KLIP的水平較低，為了進(jìn)一步提高KLIP的表達(dá)水平，選擇一個(gè)合適的表達(dá)宿主至關(guān)重要。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面有著不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：如培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易于操作、便于工業(yè)化生產(chǎn)；高穩(wěn)定性表達(dá)，可高效表達(dá)外源蛋白等［18-20］。在本研究中將克氏擔(dān)孢酵母的脂肪酶基因（klip）在畢赤酵母X33中進(jìn)行了異源表達(dá)并且測(cè)定了重組KLIP的酶學(xué)特性，為下一步對(duì)klip進(jìn)行基因改造以及高密度發(fā)酵重組KLIP酵母工程菌奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

克氏擔(dān)孢酵母V3 本實(shí)驗(yàn)室保藏；表達(dá)載體pPICZαA、畢赤酵母X33、博萊霉素（Zeocin） 美國(guó)Invitrogen公司；大腸桿菌Top10、高保真Pfu酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、質(zhì)粒提取試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、PCR純化試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；橄欖油 益海嘉里投資有限公司；不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酶底物 美國(guó)Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝；引物由深圳華大基因合成。

大腸桿菌（Escherichia coli）用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，酵母轉(zhuǎn)化子用YPDZ培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，酵母搖瓶培養(yǎng)及產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為BMGY和BMMY。LB、YPDZ、BMGY和BMMY培養(yǎng)基分別參照美國(guó)Invitrogen公司的酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行配制。

1.2儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、冷凍離心機(jī) 珠海黑馬科技有限公司；電穿孔儀、蛋白質(zhì)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；高速均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司。

1.3方法

1.3.1克氏擔(dān)孢酵母V3脂肪酶基因（klip）克隆

通過(guò)對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上已報(bào)道的序列（GenBank登錄號(hào)為：AB073866）進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用來(lái)擴(kuò)增klip。上游引物：5’-CAGCGAAT TCGCTCCTTTGGAACCTAGAGCT-3’和下游引物：5’-GACGTCTAGATTACAACAA CTTGTCCAAGGA-3’（分別含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)）。采用同源克隆法擴(kuò)增klip，以提取的克氏擔(dān)孢酵母V3基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL，2×Pfu Master Mix 50 μL，用ddH2O補(bǔ)充到總體積為100 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min后，分別于94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s和72 ℃延伸2 min，共33 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定正確后純化回收存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2表達(dá)載體pPICzαA-klip的構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)表達(dá)載體pPICzαA和目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，切膠純化后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)入E. coli Top10，在含25 μg/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上涂板，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。將陽(yáng)性質(zhì)粒提交華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacⅠ進(jìn)行線性化，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100 μg/mL的Zeocin YPD（YPDZ）平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。1.3.3 高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選及重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)

將YPDZ平板上的酵母轉(zhuǎn)化子，分別挑入含有5 mL BMGY的50 mL離心管中，30 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，離心，倒掉上清液，每個(gè)離心管中加入5 mL BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h取樣，離心，取上清液。脂肪酶活性測(cè)定參照?qǐng)?bào)道的方法進(jìn)行［21］。將篩選出的高酶活轉(zhuǎn)化子，接種于含有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到2～6。離心收集菌體，再將其重懸浮于BMMY培養(yǎng)基中，稀釋至OD600nm為1.0，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔24 h向BMMY培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.75%進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)測(cè)定重組菌的菌體濃度和脂肪酶酶活力。

1.3.4重組蛋白的純化和聚丙烯酰胺凝膠電泳

KLIP重組蛋白的純化參照文獻(xiàn)［22］報(bào)道的方法進(jìn)行。將發(fā)酵液離心取上清液，上清液即為粗酶液；將粗酶液進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜的截留分子質(zhì)量為10 kD；將超濾后的酶液進(jìn)行DEAE-Sephadex A-50離子交換層析，收集有酶活力的洗脫峰，經(jīng)透析濃縮后作為十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣液。電泳采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓控制在40 V。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.3.5重組KLIP的酶學(xué)性質(zhì)

1.3.5.1重組KLIP的溫度特性

在pH 5.0條件下測(cè)定純化后重組KLIP在30～80 ℃不同溫度下的酶活力，以測(cè)定酶活力最高的溫度下的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的相對(duì)酶活力。將純化后的重組KLIP在不同溫度下（30～80 ℃）水浴保溫1 h，在最適溫度、pH 5.0條件下測(cè)定剩余的酶活力，以未做任何處理酶液的酶活力為100%，計(jì)算其他溫度下的剩余酶活力。

1.3.5.2重組KLIP的pH值特性

在60 ℃、不同pH值（緩沖液體系分別為：pH 3～7為100 mmol/L的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液；pH 8～9 為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液）條件下測(cè)定純化后重組KLIP的活性，以活性最高pH值下的酶活力為100%，計(jì)算其他pH值條件下的相對(duì)酶活力。將純化后的重組KLIP分別在pH 3～9（緩沖液體系分別為：pH 3～7為100 mmol/L的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液；pH 8～9 為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液），30 ℃保存24 h，再于最適溫度，最適合pH值條件下測(cè)定剩余酶活力，以未做任何處理酶液的酶活力為100%，計(jì)算其他pH值條件下的剩余酶活力。

1.3.5.3金屬離子對(duì)重組KLIP活性的影響

在含有1 mmol/L不同金屬離子的環(huán)境中，將純化后的重組KLIP在30 ℃條件下保存6 h，以未加金屬離子酶液的酶活力為100%，計(jì)算其他條件下的剩余酶活力。

1.3.5.4不同去污劑對(duì)重組KLIP活性的影響

在質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的不同去污劑的環(huán)境中，將純化后的重組KLIP在30 ℃條件下保存6 h，以未加去污劑酶液的酶活力為100%，計(jì)算其他條件下的剩余酶活力。

1.3.5.5重組KLIP底物特異性

在最適溫度以及最適pH值條件下分別測(cè)定純化后的重組KLIP對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸甘油酯的催化能力，以測(cè)定酶活力最高時(shí)的底物的酶活力為100%，計(jì)算其他底物的相對(duì)酶活力。

2　結(jié)果與分析

2.1表達(dá)載體pPICzαA-klip的構(gòu)建及畢赤酵母轉(zhuǎn)化

圖1　脂肪酶基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Electrophoretogrom of PCR amplification products and restriction enzyme digestion analysis of plasmid pPICzαA-klip

以提取的克氏擔(dān)孢酵母V3的基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖1）可見(jiàn)PCR產(chǎn)物大小約為1 400 bp。將該目的片段回收并克隆到表達(dá)載體pPICzαA，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示片段大小正確，測(cè)序結(jié)果表明klip全長(zhǎng)為1 374 bp，起始和終止密碼子分別為ATG和TAA，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：表達(dá)載體pPICzαA-klip構(gòu)建成功。通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將線性化后的表達(dá)載體pPICzαA-klip轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有100 μg/mL的Zeocin YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，Zeocin YPD平板上長(zhǎng)出了數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)化子。

2.2高酶活力轉(zhuǎn)化子的篩選及重組酵母菌搖瓶培養(yǎng)

按照方法1.3.3節(jié)從隨機(jī)挑選出來(lái)的50 個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選得到一株產(chǎn)重組KLIP酶活力較高的轉(zhuǎn)化子，命名為K1。將篩選出的高酶活轉(zhuǎn)化子K1，按照方法1.3.3節(jié)用搖瓶進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)量菌濃和上清發(fā)酵液的酶活力。結(jié)果如圖2所示：誘導(dǎo)至120 h時(shí)，酶活力達(dá)到18 U/mL（搖瓶培養(yǎng)條件下，克氏擔(dān)孢酵母V3表達(dá)KLIP的最大酶活力為6 U/mL）；誘導(dǎo)至144 h時(shí)，菌體的OD600nm值達(dá)到最大值為45。

圖2　重組畢赤酵母產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線Fig.2 Cell growth and lipase production of recombinant yeast

2.3重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

發(fā)酵上清液經(jīng)截留分子質(zhì)量為10 kD的膜超濾、DEAE-Sephadex A-50離子交換層析純化后，得到酶活回收率為58%，純化倍數(shù)為3.50 倍的純酶（表1）。將純化后的重組KLIP進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖3可知，重組酶分子質(zhì)量約49 kD，這與經(jīng)ExPASy Proteomics Server軟件對(duì)重組KLIP的氨基酸序列進(jìn)行分子質(zhì)量預(yù)測(cè)值接近。

表1　重組蛋白的純化Table1 Purification of recombinant lipase

圖3　重組KLIP的SDS-PAGEE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase

2.4重組KLIP的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1重組KLIP的溫度特性

在pH 5.0條件下，分別在不同溫度下測(cè)定純化后重組KLIP的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。在30～60 ℃范圍內(nèi)重組KLIP的酶活力逐漸上升，在60～80 ℃范圍內(nèi)重組KLIP的酶活力逐漸下降，說(shuō)明重組KLIP的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。耐溫性方面：將純化后的重組KLIP分別在30～80 ℃水浴保溫1 h，再在pH 5.0，60 ℃條件下測(cè)定剩余酶活力。結(jié)果表明：在30～60 ℃范圍內(nèi)，重組KLIP具有較好的穩(wěn)定性，剩余酶活力可達(dá)到97%以上；當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃，酶的活性急劇下降，在80 ℃時(shí)酶活力為對(duì)照的41%。

圖4　重組脂肪酶最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of the recombinant lipase

2.4.2重組KLIP的pH值特性

在60 ℃，不同pH值條件下測(cè)定純化后重組KLIP的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。在pH 3～5范圍內(nèi)，隨著pH值的升高酶活力逐漸升高，在pH 5～9范圍內(nèi)重組KLIP的活性逐漸下降，說(shuō)明重組KLIP的最適pH值為5。將純化后的重組KLIP在不同pH值條件下室溫保存24 h后測(cè)定其剩余酶活力，結(jié)果表明重組KLIP在pH 3～7范圍內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性，剩余酶活力均達(dá)到80%以上，當(dāng)pH值大于7時(shí)，重組KLIP的活性急劇下降。在pH 8的條件下放置24 h后，剩余酶活力僅為20%。

圖5　重組脂肪酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of the recombinant lipase

2.4.3金屬離子對(duì)重組KLIP活性的影響

表2　不同金屬離子對(duì)重組脂肪酶活性的影響Table2 Effects of different metal ions on the activity of the recombinant lipase

由表2可知，1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+對(duì)重組KLIP具有激活作用，與對(duì)照相比對(duì)照分別提高5%、3%和1%。除了Fe3+其他金屬離子對(duì)重組KLIP活性的影響較小，相對(duì)酶活力都在83%～100%之間。

2.4.4不同去污劑對(duì)重組KLIP活性的影響

表3　不同去污劑對(duì)重組脂肪酶活性的影響Table3 Effects of different detergents on the activity of the recombinant lipase pase

由表3可知，質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的不同去污劑的環(huán)境中，吐溫-80、吐溫-20以及曲通-100對(duì)重組KLIP具有激活作用，與對(duì)照相比分別提高6%、8%和11%；SDS對(duì)重組KLIP的活性具有強(qiáng)烈的抑制作用，在含有1 g/100 mL SDS的條件下保存6 h后，相對(duì)酶活力僅為對(duì)照的20%。

2.4.5重組KLIP的底物特異性

圖6　重組脂肪酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of the recombinant lipase

由圖6可知，重組KLIP對(duì)長(zhǎng)碳鏈底物的活性高于短碳鏈的底物。重組KLIP的最適底物為三硬脂酸甘油酯（C18），其次對(duì)三丁酸甘油酯（C4）的活性較高。

3　討 論

到目前為止，關(guān)于酵母脂肪酶的研究主要集中在CRL、CALB以及YLLip2。以上3 種脂肪酶均存在的缺點(diǎn)是酶的熱穩(wěn)定性差：如CRL在溫度為55 ℃條件下，檢測(cè)不到酶活力；當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃，CALB的穩(wěn)定性較差；YLLip2在45 ℃水浴保溫30 min后，剩余酶活力僅為20%［14-16］。相對(duì)于CRL、CALB以及YLLip2，重組KLIP則具有很好的熱穩(wěn)定性。重組KLIP的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在60 ℃和70 ℃水浴保溫1 h后剩余酶活力分別為97%和65%。由于重組KLIP良好的熱穩(wěn)定性，使其在工業(yè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

畢赤酵母作為一種成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)，在蛋白質(zhì)表達(dá)方面有著許多優(yōu)點(diǎn)：如培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、易于操作、便于工業(yè)化生產(chǎn)、可高效的表達(dá)外源蛋白等。本實(shí)驗(yàn)將klip在畢赤酵母X33中進(jìn)行了異源表達(dá)。在搖瓶培養(yǎng)條件下，重組酵母工程菌分泌表達(dá)KLIP的能力是野生型克氏擔(dān)孢酵母的3 倍（搖瓶培養(yǎng)條件下，重組工程菌為18 U/mL，克氏擔(dān)孢酵母為6 U/mL）。本實(shí)驗(yàn)采用的基因是從克氏擔(dān)孢酵母中克隆的原始基因，考慮到畢赤酵母表達(dá)外源基因具有密碼子偏好性，今后通過(guò)對(duì)klip進(jìn)行密碼子優(yōu)化可進(jìn)一步提高畢赤酵母表達(dá)此酶的能力。

本研究成功實(shí)現(xiàn)了klip的高效表達(dá)，為該基因的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，今后通過(guò)進(jìn)一步完善發(fā)酵和分離純化工藝，以及采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)等技術(shù)，以最大化提高KLIP的產(chǎn)量和活性，使其能最終應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Overexpression of the Lipase Gene from Kurtzmanomyces in Pichia pastoris

WANG Jianrong， LIU Danni， LI Peng， LI Yangyuan*
（Guangdong VTR Bio-tech Co. Ltd.， Zhuhai 519060， China）

A stable and highly effective expression system was constructed for the expression of the lipase gene from Kurtzmanomyces sp. V3. The lipase gene was isolated by homologous cloning， inserted into the expression vector pPICZαA and transformed into Pichia pastoris X33. The results showed that the gene was expressed successfully in Pichia pastoris X33. The optimal temperature and pH of the recombinant lipase were 60 ℃ and 5.0， respectively. Its activity was stimulated by 1 mmol/L Mg2+， K+and Na+， and 1 g/100 mL Triton-100， Tween-80 and Tween-20. The recombinant lipase showed high activity toward tristearin （C18）.

Kurtzmanomyces； lipase； Pichia pastoris

Q81

A

1002-6630（2015）03-0104-05

10.7506/spkx1002-6630-201503020

2014-03-12

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA093514）

王建榮（1985—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ?。E-mail：believe1234@126.com

李陽(yáng)源（1983—），男，副高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與酶學(xué)。E-mail：liyangyuanvtr@163.com