易桂標(biāo)， 楊 麗， 郝仁方， 張中菊

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州　遵義　563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州　遵義　563003；3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州　遵義　563002）

青藤堿對偏頭痛模型大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB和COX-2表達的影響

易桂標(biāo)1，2， 楊 麗1*， 郝仁方1， 張中菊3

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院研究生院，貴州遵義563003；3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州遵義563002）

目的 研究青藤堿對偏頭痛大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)（PAG）核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達的影響，探討青藤堿治療偏頭痛的可能機制。方法 60只健康SD大鼠隨機分成對照組、模型組、尼美舒利組、青藤堿低、中、高劑量組，復(fù)制硝酸甘油型偏頭痛大鼠。尼美舒利為陽性對照組，在制模、藥物干預(yù)后，免疫組化檢測大鼠PAG區(qū)NF-κB和COX-2陽性表達。結(jié)果 ①與對照組比較，模型組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；②與模型組比較，尼美舒利組和青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；③與尼美舒利組比較，青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論 NF-κB、COX-2參與了偏頭痛發(fā)病過程；青藤堿能較好地緩解硝酸甘油型偏頭痛大鼠行為學(xué)變化，推測其作用機制可能是通過抑制PAG區(qū)NF-κB和COX-2的表達。

青藤堿；偏頭痛；中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；環(huán)氧化酶-2

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）是參與中樞內(nèi)源性鎮(zhèn)痛調(diào)控的重要結(jié)構(gòu)，內(nèi)含有多種與偏頭痛發(fā)作密切相關(guān)的炎性因子、神經(jīng)肽類、神經(jīng)遞質(zhì)以及雌激素及其相關(guān)受體［1-2］。青藤堿（正清風(fēng)痛寧主要成分）是目前臨床上用于治療風(fēng)濕類疾病的中成藥，鎮(zhèn)痛、抗炎療效顯著。將青藤堿注入家兔腹腔、靜脈所能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的劑量是側(cè)腦室的12 000倍、13 000倍，表明其作用部位主要位于中樞［3］。青藤堿的鎮(zhèn)痛、抗炎效應(yīng)是否也可作用于PAG區(qū)，用于治療偏頭痛未見文獻報道，故取其鎮(zhèn)痛抗炎的療效，觀察其對偏頭痛模型大鼠行為癥狀的改變和鎮(zhèn)痛效果，來探討作用于偏頭痛的可能機制與途徑，為臨床使用提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠（雌雄等數(shù)）60只，體質(zhì)量（270±30）g，從第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心購得，許可證號為SCXK（渝）20070005。

1.1.2藥物和主要試劑 青藤堿（正清風(fēng)痛寧主要成分）由湖南正清制藥提供；硝酸甘油注射液從河南潤弘制藥購得；尼美舒利從海南新中正制藥有限公司購得；NF-κB p65檢測試劑盒從北京中衫金橋試劑公司購得；COX-2檢測試劑盒從武漢博士德試劑公司購得。

1.2方法

1.2.1實驗大鼠分組及制模與干預(yù) SD大鼠隨機分為對照組、模型組、尼美舒利組、青藤堿低、中、高劑量組，每組10只，分籠飼養(yǎng)。除對照組不作特殊處理外，余各組均皮下注射硝酸甘油注射劑2 mL（10 mg/kg）制備偏頭痛大鼠模型，隔天注射1次，共5次。在第2次造模后，尼美舒利按每日每次6 mg/kg灌服尼美舒利組，青藤堿按每日每次50 mg、100 mg、200 mg/kg灌服青藤堿低、中、高劑量組，每天灌服1次，連續(xù)7 d。

1.2.2硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備及行為學(xué)評價 造模：遵從Tassorelli將硝酸甘油注射液以10 mg/kg在大鼠頸部皮下注射制模，約4 min左右大鼠出現(xiàn)兩耳充血發(fā)紅，前肢不停撓頭，爬籠明顯，煩躁不安等被視作造模成功［4］。

評估：①耳紅即記錄大鼠制模后耳紅開始及消失時間。②撓頭即記錄大鼠制模后撓頭開始及消失時間。撓頭開始時間，以連續(xù)撓頭達5次以上為準(zhǔn)，消失時間，則以一個時間段中大鼠撓頭次數(shù)少于5次并出現(xiàn)倦怠、疲乏為準(zhǔn)。③撓頭次數(shù)即從制模后開始，每30 min為一個時間段，持續(xù)分段記錄撓頭次數(shù)［5］。

1.2.3切片制備及免疫組織化學(xué) 大鼠最后一次造模、灌服藥后3 h，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后，仰臥固定，剪開胸、腹腔，從心尖部緩慢置入穿刺針達主動脈并固定，剪破右心房。先快速灌注無菌生理鹽水100～200 mL，隨后灌注4℃4%多聚甲醛液100～200 mL，至大鼠肢體強直變硬、尾巴豎立后，終止灌注。斷頭后，依據(jù)諸葛啟釧主譯的《大鼠腦立體定位圖譜》剝離中腦PAG區(qū)域的位置組織，于4%多聚甲醛液浸泡固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋。于石蠟切片機對其行連續(xù)冠狀面切片，切片厚度25μm，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片，烤片機中58℃2 h烤干備用。石蠟切片，取1張貼于普通載玻片行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，行切片免疫組化染色。采用SABC法。操作步驟嚴(yán)格按說明書進行。

1.2.4陽性細胞記數(shù) 在光學(xué)顯微鏡下：NF-κB陽性細胞為卵形或梭形，細胞漿呈棕褐色。COX-2陽性細胞，染色較淡，主要為細胞核染色，隨著染色程度的不同呈現(xiàn)棕灰色或棕色。每張切片40倍鏡下取左上、下，右上、下和中央5個鏡野，計數(shù)每個鏡野陽性細胞總數(shù)，取均值。

2　結(jié)果

2.1大鼠行為癥狀學(xué)變化 硝酸甘油造模約30 min后，大鼠除對照組外，其余各組均出現(xiàn)兩耳發(fā)赤，前肢不停搔頭，爬籠、活動明顯，煩躁不安等現(xiàn)象，此過程延續(xù)約3 h，繼而出現(xiàn)倦怠、蜷臥，活動減少。在藥物干預(yù)后，藥物干預(yù)組與模型組耳紅及撓頭開始時間比較，無明顯差異；青藤堿高劑量及尼美舒利干預(yù)組耳紅及撓頭消失的時間較模型組大鼠明顯縮短；藥物干預(yù)組大鼠各時間段撓頭次數(shù)與模型組比較差異明顯，具體結(jié)果見表1～2。

表1　各組大鼠耳紅、撓頭時間比較（±s，m in）

表1　各組大鼠耳紅、撓頭時間比較（±s，m in）

注：與模型組比較，*P＜0.05

組別動物數(shù)耳紅開始時間耳紅結(jié)束時間撓頭開始時間撓頭結(jié)束時間模型組10 3.47±0.36 179.58±3.64 4.33±0.53 182.12±13.11尼美舒利組10 3.52±0.53 162.36±7.39*4.17±0.75 163.28±8.10*青藤堿低劑量組10 3.54±0.50 178.49±6.06 4.37±0.68 177.34±8.27青藤堿中劑量組10 3.50±0.92 177.08±3.99 4.47±0.52 176.16±2.43青藤堿高劑量組10 3.63±0.91 162.94±11.34*4.22±0.85 158.60±7.79*

表2　大鼠不同時間段撓頭次數(shù)的比較（±s，次數(shù)/30m in）

表2　大鼠不同時間段撓頭次數(shù)的比較（±s，次數(shù)/30m in）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

0～30 min 31～60 min 61～90 min 91～120 min 121～150 min 151～180 min對照組組別動物數(shù)10 1.70±1.06 1.10±0.99 1.20±1.03 1.00±0.94 1.00±0.94 0.90±0.57模型組10 35.70±4.79*43.10±5.70*42.90±4.31*31.80±6.07*25.20±4.96*3.70±1.89*尼美舒利組10 24.00±5.98*#26.80±3.79*#27.00±3.37*#26.70±6.78*#14.90±2.99*#1.40±0.84*#正清風(fēng)痛寧低劑量組10 32.90±5.17*33.90±2.92*#34.10±2.33*#29.40±4.22*24.65±5.37*2.90±1.73*正清風(fēng)痛寧中劑量組10 30.00±2.94*#33.30±3.92*#32.90±3.57*#21.10±3.21*#16.3±4.03*#2.70±0.95*正清風(fēng)痛寧高劑量組10 26.37±5.09*#29.90±4.01*#31.30±3.65*#19.5±4.14*#15.50±1.58*#1.70±1.06*#

2.2免疫組化檢測 結(jié)果見表3及圖1。

表3　各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2陽性細胞表達結(jié)果

圖1顯示了各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2陽性細胞表達結(jié)果：模型組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達與對照組比較，明顯增多；尼美舒利組和青藤堿高劑量組（PAG）區(qū)NF-κB、COX-2表達與模型組比較，明顯減少；青藤堿高劑量組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達與尼美舒利組比較，無明顯差異。

3　討論

NF-κB是許多靶因的多效性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于細胞胞漿中，習(xí)慣上NF-κB主要為p50/p65異源二聚體，參與不少同炎癥、免疫功能相關(guān)基因的調(diào)控。運用電刺激上矢狀竇區(qū)硬腦膜復(fù)制的偏頭痛大鼠，在其PAG內(nèi)NF-κB蛋白表達明顯增強［2，6］。預(yù)防性予以含NF-κB抑制劑的龍牙草，已被證明，可使偏頭痛爆發(fā)頻率減少、減緩其癥狀［7］。COX-2被稱為“炎癥反應(yīng)基因”，并且是偏頭痛發(fā)作時的重要炎性介質(zhì)前列腺素（PG），尤其是前列腺素-E2（PGE2）合成的關(guān)鍵酶。研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶（COX）抑制劑能緩解偏頭痛發(fā)作，現(xiàn)已被試用于偏頭痛的臨床治療［8］。COX-2的表達受NF-κB調(diào)控，NF-κB、COX-2是否與偏頭痛聯(lián)系密切，值得進一步研究。

硝酸甘油偏頭痛大鼠模型能較好地模擬人類偏頭痛發(fā)病時的表現(xiàn)，其行為癥狀變化是能用于客觀且能量化評價偏頭痛治療藥物療效的合理指標(biāo)［5］，其造模的主要原理之一是硝酸甘油在機體內(nèi)通過一系列生理、生化反應(yīng)，從而介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥引發(fā)偏頭痛，所以還適于進行神經(jīng)源性炎癥機制研究。無先兆偏頭痛是偏頭痛中最主要的類型，參照國際頭痛協(xié)會（2004年）制訂的無先兆偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中之一是至少發(fā)作5次，故本實驗共造模5次。

圖1　各組大鼠中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)區(qū)NF-κB與COX-2表達

中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）內(nèi)炎性因子（如核轉(zhuǎn)錄因子-κB、環(huán)氧化酶-2、白介素-1等）、神經(jīng)肽類，神經(jīng)遞質(zhì)（如5-羥色胺、一氧化氮等）、雌激素等及其相關(guān)受體的含量變化及其功能異常，常可使PAG的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生紊亂，進而影響了其對偏頭痛中樞疼痛的調(diào)控，在一定程度上可能促進了偏頭痛的發(fā)作。

神經(jīng)源性炎癥機制是目前闡述偏頭痛病理機制學(xué)說的主流。該學(xué)說認為NF-κB的激活是神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)中的主要內(nèi)容之一。靜息狀況時，NF-κB通常以非活化狀態(tài)存于胞漿中，遇到傷害性刺激后，NF-κB迅速轉(zhuǎn)位入胞核并結(jié)合特異性κB序列，進而被激活，誘導(dǎo)調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（如COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、iNOS等）產(chǎn)生與轉(zhuǎn)錄，繼而造成腦血管周圍組織的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)偏頭痛發(fā)作。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)：硝酸甘油復(fù)制的偏頭痛模型大鼠PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達相比于對照組明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示硝酸甘油誘發(fā)了模型組PAG區(qū)的炎癥反應(yīng)，促使了NF-κB神經(jīng)元的激活，進而誘導(dǎo)了COX-2基因轉(zhuǎn)錄的大量增加，從而啟動了神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，同時也可導(dǎo)致PAG的功能紊亂，從而失去了對中樞疼痛的調(diào)控，由此引發(fā)了大鼠偏頭痛樣癥狀發(fā)作，同時也較好地驗證神經(jīng)源性炎癥在偏頭痛中的作用。并同時觀察到在予以青藤堿、尼美舒利干預(yù)后，大鼠行為學(xué)改變與模型組相比，緩解明顯，且青藤堿高劑量組和尼美舒利組PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達與模型組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示兩者對NF-κB、COX-2的抑制效應(yīng)相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示正青藤堿與尼美舒利一樣，對治療偏頭痛有效，其作用機制可能與抑制PAG區(qū)神經(jīng)細胞NF-κB、COX-2表達有關(guān)。

尼美舒利是環(huán)氧化酶-2抑制劑，故本研究選取尼美舒利為陽性對照組。同時其抗炎、鎮(zhèn)痛作用顯著，臨床上用尼美舒利治療偏頭痛療效也不錯［9-10］。青藤堿（Sin）化學(xué)結(jié)構(gòu)與嗎啡類似，和腦的阿片受體或許有特殊的親和力，并可透過血腦屏障［11］；研究證實青藤堿在小鼠中腦分布濃度較在大腦和小腦的濃度升高顯著［12］；這些都是青藤堿具有中樞鎮(zhèn)痛作用的有力證據(jù)。其抗炎效應(yīng)與皮質(zhì)類激素氟美松相當(dāng)［13］，作用機理可能是干預(yù)了NF-κB激活通路，從而抑制炎癥局部前列腺素的合成或釋放［3］。實驗結(jié)果顯示這兩者在緩解硝酸甘油誘發(fā)的偏頭痛大鼠的行為癥狀學(xué)方面效果明顯。

綜上所述，本實驗顯示青藤堿能夠明顯緩解偏頭痛模型大鼠的行為癥狀學(xué)變化，因此推測可能對偏頭痛治療有效。前期研究表明：青藤堿可下調(diào)偏頭痛模型大鼠腦干炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達，抑制c-fos、c-jun基因表達及5-HT能系統(tǒng)的激活［14-16］，本實驗結(jié)果顯示在偏頭痛模型大鼠PAG區(qū)NF-κB、COX-2表達增高，用一定劑量的青藤堿干預(yù)偏頭痛大鼠其行為癥狀學(xué)變化有較好的改善作用，其機制可能是通過抑制腦干PAG區(qū)神經(jīng)NF-κB、COX-2的表達，下調(diào)炎癥因子（IL-1β、TNF）的釋放［17］，從而抑制了神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，而達到緩解行為癥狀學(xué)的作用，以達到止痛目的。由此推測青藤堿對偏頭痛治療有一定的療效，到底有沒有效，還需要大樣本的臨床觀察才能定論。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0678-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.051

2014-01-18

遵義市科技局基金（201133）

易桂標(biāo)（1984—），男，碩士生，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。Tel：15200203825，E-mail：451241950@qq.com

楊 麗（1957—），女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事偏頭痛及腦血管疾病研究。Tel：（0852）28608747，E-mail：yangli1668@126.com