趙清輝， 王 琳， 陳慧芳， 謝欣梅， 龐曉斌

（河南大學(xué)藥物研究所，河南　開(kāi)封　475004）

降糖寧膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞糖代謝作用及其作用機(jī)制的研究

趙清輝， 王 琳， 陳慧芳， 謝欣梅， 龐曉斌*

（河南大學(xué)藥物研究所，河南開(kāi)封475004）

目的 觀察降糖寧膠囊（人參、山藥、石膏、知母等）對(duì)HepG2細(xì)胞糖代謝的影響，并探討其降糖機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)降糖寧對(duì)細(xì)胞活力的影響；HE染色法觀察降糖寧對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響；采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)降糖寧對(duì)細(xì)胞糖消耗的影響；Western-blot檢測(cè)磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及人胰島素受體底物（IRS1）表達(dá)量。結(jié)果 降糖寧膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞的活力和形態(tài)無(wú)明顯影響，可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗，能促進(jìn)AMPKβ1/2、IRS1蛋白表達(dá)量。結(jié)論 降糖寧膠囊的降糖機(jī)制可能涉及對(duì)胰島素受體信號(hào)通路及AMPK信號(hào)通路的影響。

降糖寧膠囊；HepG2；糖代謝；AMPK；IRS1

隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糖尿病發(fā)病率逐年上升。目前全世界至少有1.71億人罹患糖尿病，到2030年患病人數(shù)可能倍增達(dá)3.66億人，而我國(guó)的糖尿病患者現(xiàn)已達(dá)4 000多萬(wàn)［1］。如果不控制血糖水平，繼發(fā)的心血管事件將最終成為糖尿病患者致死、致殘的最主要原因。目前臨床應(yīng)用的降糖藥主要有雙胍類(lèi)、磺酰脲類(lèi)、噻唑烷二酮類(lèi)、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素及其類(lèi)似物。但是這些藥物都會(huì)有一定的不良反應(yīng)和不足之處［2］。臨床實(shí)驗(yàn)表明中藥在治療糖尿病方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用，并且不良反應(yīng)相對(duì)較低，降糖作用溫和持久［3-5］。

降糖寧膠囊由人參、山藥、生石膏、知母、黃芪、天花粉、茯苓、麥冬、生地黃、地骨皮、玉米須、山茱萸、甘草組成，具有降糖降脂，增強(qiáng)Ⅱ型糖尿病人的耐糖能力和增加肝糖原的量、改善脂代謝的作用［6］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其中的有效成分具有降血糖、抗氧化、抗焦慮，抗疲勞等多種藥理作用［7-8］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，降糖寧膠囊對(duì)于四氧嘧啶引起的糖尿病大鼠有良好的療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察降糖寧膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞的作用，探索其體外降糖作用及其降糖機(jī)制。

1　材料

1.1藥品與試劑 人肝癌HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。降糖寧膠囊（吉林天強(qiáng)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20054733）。DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司）；小牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）、羅格列酮、牛胰島素（美國(guó)Sigma公司）；BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京平原皓生物技術(shù)有限公司）；兔AMPKβ1/2、IRS1、β-actin多克隆抗體，熒光標(biāo)記二抗（美國(guó)Cell Signal公司）。

1.2儀器 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD蘇州凈化設(shè)備有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（3432 Thermo Fisher Scientific）；倒置顯微鏡（ECLIPSE TS100-F NIKON）；酶標(biāo)儀（SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH）；凝膠成像系統(tǒng)（JYO4S-3B北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

2　方法

2.1藥物處理 取降糖寧膠囊0.4 g溶于10 mL DMSO中過(guò)夜，在潔凈工作臺(tái)里，分別用0.44μm和0.22μm的濾器過(guò)濾，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同質(zhì)量濃度的藥液備用。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為6×103個(gè)/孔，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，更換DMEM培養(yǎng)基，并于每孔加入不同質(zhì)量濃度的降糖寧，使其終質(zhì)量濃度分別為1×10-5、1×10-4、1×10-3、1× 10-2、1×10-1、1、10、100 mg/L。并設(shè)空白調(diào)零孔（只加DMEM培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度（OD）值。吸光度值高低反映細(xì)胞的活力。

2.4細(xì)胞形態(tài)的觀察 將蓋玻片放入6孔板中，1×10-3mg/L降糖寧藥物作用36 h后取出蓋玻片，PBS洗兩遍，95%乙醇固定20 min，PBS洗兩遍，木素染液染核3 min，自來(lái)水洗滌，鏡檢，浸入伊紅染液染色1 min，自來(lái)水洗滌，鏡檢拍照。

2.5葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以6×103個(gè)/孔接種在96孔板。實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、降糖寧組、胰島素組（3×10-7mol/L）及羅格列酮組（3× 10-5mol/L）。降糖寧的終質(zhì)量濃度分別為1× 10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/L。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥24、36、48 h后以葡萄糖氧化酶法檢測(cè)培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖量。以未接種細(xì)胞的空白組的葡萄糖量均值減去各組測(cè)得的培養(yǎng)液中葡萄糖量即得各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

2.6Western-blot法檢測(cè)AMPKβ1/2、IRS1蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以6×103個(gè)/孔接種在96孔板。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、降糖寧組（1×10-3、1×10-4、1×10-5mg/L）、羅格列酮組（3×10-5mol/L）。培養(yǎng)24 h，收集相應(yīng)處理后的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的Western細(xì)胞裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白。配置10%分離膠和濃縮膠，取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入AMPKβ1/2（1∶1 000）、IRS1（1∶1 000）一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗5遍，二抗（1∶2 000）孵育2 h，TBST洗5遍，通過(guò)ECL試劑盒進(jìn)行顯影檢測(cè)。結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行灰度值分析。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1×10-5～100 mg/L范圍的降糖寧膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞的活力均沒(méi)有明顯影響（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

3.2降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在1×10-3mg/L降糖寧膠囊對(duì)HepG2作用36 h后，光鏡下HE染色觀察可見(jiàn)HepG2細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核藍(lán)染。核大，多核，核質(zhì)比例失調(diào)呈典型腫瘤細(xì)胞形態(tài)特征?？瞻捉M與加藥組相比較，未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖2。

3.3降糖寧膠囊對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響

與對(duì)照組相比，降糖寧膠囊作用于細(xì)胞后均可增加細(xì)胞的糖消耗。24 h糖消耗增加率為19.71%～40.89%，36 h糖消耗率增加為24.01%～42.15%，48 h糖消耗率增加為6.96%～16.12%。結(jié)果顯示，各組糖消耗在36 h時(shí)最高，降糖寧的最大有效質(zhì)量濃度為1×10-3mg/L，糖消耗量高于各時(shí)間胰島素組和羅格列酮組。見(jiàn)表1。

圖1　降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響（n=3，±s）Fig.1 Effect of Jangtangning Capsules on cell viability in HepG2（n=3，±s）

圖2　HepG2細(xì)胞HE染色結(jié)果（×400）Fig.2 HE stained graph of HepG2 cells in control and test groups（×400）

表1　降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=3，±s）Tab.1 Effect of Jiangtangning Capsules on glucose consumption in HepG2 cell（n=3，±s）

表1　降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=3，±s）Tab.1 Effect of Jiangtangning Capsules on glucose consumption in HepG2 cell（n=3，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量葡萄糖消耗/（mmol·L-1）24 h 36 h 48 h對(duì)照組0 2.042±0.287 2.771±0.207 5.002±0.328胰島素組3×10-7mol/L 2.668±0.614*3.450±0.206*5.230±0.305羅格列酮3×10-5mol/L 2.701±0.402*3.610±0.389*5.539±0.411降糖寧組1×10-6mg/L 2.444±0.126*3.436±0.227**5.348±0.337降糖寧組1×10-5mg/L 2.682±0.131*3.688±0.134**5.412±0.137降糖寧組1×10-4mg/L 2.659±0.117*3.668±0.158**5.475±0.192降糖寧組1×10-3mg/L 2.877±0.049*3.939±0.102**5.806±0.064*降糖寧組1×10-2mg/L 2.812±0.099*3.831±0.137**5.596±0.130*降糖寧組1×10-1mg/L 2.792±0.015*3.765±0.227**5.777±0.193*

3.4降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞IRS1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)降糖寧作用后，HepG2細(xì)胞IRS1蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05），并且不同質(zhì)量濃度的降糖寧膠囊呈劑量依賴性的增加IRS-1蛋白表達(dá)量。見(jiàn)圖3。

圖3　降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞IRS1蛋白表達(dá)的影響（n= 3，±s）Fig.3 Effect of Jangtangning Capsules on the expression of IRS1in HepG2 cells（n=3，±s）

3.5降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞AMPKβ1/2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)降糖寧作用后，HepG2細(xì)胞中AMPKβ1/2蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05），并呈劑量依賴關(guān)系。1×10-3μg/mL組蛋白表達(dá)量比羅格列酮略高。見(jiàn)圖4。

圖4　降糖寧對(duì)HepG2細(xì)胞AMPKβ1/2蛋白表達(dá)的影響（n=3，±s）Fig.4 Effect of Jangtangning Capsules on the expression of AMPKβ1/2 in HepG2 cells（n=3，±s）

4　討論

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，是由于體內(nèi)胰島素的絕對(duì)缺乏或相對(duì)不足，或其他原因造成其不能發(fā)揮正常生理作用，而引起的以糖代謝紊亂為主的一種代謝混亂綜合病癥。高血糖是其主要特征，常用降糖藥物有化學(xué)藥、胰島素類(lèi)、中藥等，中醫(yī)藥在治療糖尿病方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性。降糖寧膠囊是臨床常用中成藥，降糖效果顯著，但降糖機(jī)制研究較少。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞探討降糖寧的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，降糖寧對(duì)細(xì)胞形態(tài)及活力無(wú)明顯影響，說(shuō)明降糖寧對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物是否具有降糖作用的常用體外方法之一［9］，常用的細(xì)胞系有HepG2人肝癌細(xì)胞、3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞、L6大鼠骨骼肌細(xì)胞［10-11］。本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示降糖寧膠囊可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖消耗，在1×10-6～1×10-1mg/L范圍內(nèi)均有很好的降糖作用，最大有效質(zhì)量濃度為1×10-3mg/L。

胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）是參與胰島素及其他細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化蛋白，其家族目前已發(fā)現(xiàn)有4個(gè)成員IRS1～I(xiàn)RS4［12］。胰島素受體（IR）與IRS結(jié)合后，使其自身及IRS磷酸化，磷酸化了的IRS與多種含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合，并使之激活，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）的合成，啟動(dòng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝?。?3］。本研究結(jié)果表明1×10-5～1×10-3mg/L范圍內(nèi)的降糖寧膠囊均能增加細(xì)胞IRS1蛋白表達(dá)量，并且呈劑量依賴性關(guān)系。說(shuō)明降糖寧的降糖作用與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物的表達(dá)增加有關(guān)。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activate protein kinas，AMPK），是由起催化作用的α亞基和起調(diào)節(jié)作用的β亞基與γ亞基組成的異三聚體［14］。AMPK作為一種重要的蛋白激酶參與多種代謝過(guò)程，其活性受AMP/ATP比值調(diào)控，被稱為細(xì)胞的“代謝感受器”［15-16］。研究發(fā)現(xiàn)，多種降糖藥，如改善胰島素抵抗的二甲雙胍、噻唑烷二酮類(lèi)和α-硫辛酸等均可以激活A(yù)MPK，此外，苦瓜提取物、白藜蘆醇、小檗堿、多酚類(lèi)、三萜類(lèi)等天然藥物也被發(fā)現(xiàn)能夠激活A(yù)MPK［17-18］。研究表明，AMPK的作用主要有：增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)位以增強(qiáng)外周組織對(duì)葡萄糖的攝取；調(diào)控糖脂代謝的基因表達(dá)；AMPK的激活可以促進(jìn)過(guò)氧化物酶增殖激活物受體（PPAR-γcoactivator 1α，PGC-1α）的表達(dá)及活化。PGC-1α表達(dá)增加，通過(guò)促進(jìn)線粒體再生，改善糖脂代謝紊亂和線粒體呼吸功能，從而改善胰島素抵抗［19］。本研究結(jié)果表明1×10-5～1×10-3mg/L質(zhì)量濃度的降糖寧膠囊均可提高AMPKβ1/2蛋白的表達(dá)量，提示AMPK信號(hào)通路可能是降糖寧發(fā)揮降糖作用的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)中IRS1與AMPK蛋白水平均有增加的趨勢(shì)，提示降糖寧膠囊促進(jìn)細(xì)胞葡萄糖消耗可能是通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)IRS的磷酸化水平，影響胰島素信號(hào)的下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)激活A(yù)MPK，改善胰島素抵抗，從而起到增加細(xì)胞葡糖糖的消耗，達(dá)到降糖作用。

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Glucometabolism of Jiangtangning Capsules on HepG2 cells and itsmechanism

ZHAO Qing-hui， WANG Lin， CHEN Hui-fang， XIE Xin-mei， PANG Xiao-bin*
（Institute of Pharmacy，Henan Uniυersity，Kaifeng 475004，China）

AIM To explore the effect of Jiangtangning Capsules（Ginseng Radix et Rhizoma，Dioscoreae Rhizoma，Gypsum Fibrosum，Anemarrhenae Rhizoma，etc.）on glucose metabolism of HepG2 cells inυitro and its mechanism.METHODS MTT assay was used tomeasure the viability of the HepG2 cells.HE stainingwas used for the observation of themorphological changes in HepG2 cells under the influence of Jiangtangning Capsules and glucose consumption was detected by oxidation enzyme method.The AMP-activated protein kinase（AMPK）and IRS-activated protein kinase（IRS1）were examined by Western-blot.RESULTS Jiangtangning Capsules could obviously promote the glucose consumption，AMPKβ1/2，and the IRS1 protein expression of the HepG2 cellswithout affecting its viability or causing morphological change.CONCLUSION The hypoglycemic mechanism of Jiangtangning Capsulesmay be associated with insulin receptor signaling pathways and AMPK pathway.

Jiangtangning Capsules；HepG2；glucometabolism；AMPK；IRS1

R285.5

A

1001-1528（2015）03-0483-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.004

2014-05-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273652）

趙清輝（1989—），男，碩士生，研究方向?yàn)樗幬锖Y選及評(píng)價(jià)。E-mail：1178968651@qq.com

龐曉斌（1973—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)樗幬锖Y選。Tel：（0371）23880680，E-mail：hndxpxb@163.com