方媛 楊森 張昭

摘 要：硫酸卷曲霉素生產(chǎn)使用纏繞鏈霉菌，是多肽類(lèi)結(jié)構(gòu)的二線抗結(jié)核新型藥物；在此次研究過(guò)程中，菌種分別采用紫外線誘變法和快中子輻射進(jìn)行了菌種選預(yù)，經(jīng)過(guò)菌種選育，使得發(fā)酵單位增長(zhǎng)了10%以上；并且為了提高原液的質(zhì)量，增加產(chǎn)品的品質(zhì)，我們通過(guò)對(duì)過(guò)濾工藝的更新，將發(fā)酵液酸化pH值和過(guò)濾溫度控制工藝優(yōu)化試驗(yàn)，成功的減少了CAⅠ前雜質(zhì)的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：卷曲霉素；菌種選育；過(guò)濾優(yōu)化

卷曲霉素主要用于治療結(jié)核病，結(jié)核病高發(fā)帶在落后地區(qū)和貧困人群，提高技術(shù)指標(biāo)、降低生產(chǎn)成本，不僅能給公司帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益，也能帶來(lái)良好的社會(huì)效益。發(fā)酵單位高低是影響卷曲霉素生產(chǎn)成本的主要因素之一，而菌種的不穩(wěn)定性是造成發(fā)酵水平較低的主要原因。優(yōu)良菌株的選育能大幅提高菌株產(chǎn)生有利用價(jià)值代謝產(chǎn)物的水平，還可以改進(jìn)產(chǎn)品質(zhì)量；是生產(chǎn)水平不斷提高，使抗生素工業(yè)迅速發(fā)展的關(guān)鍵之一。由此我們將加大育種的力度并進(jìn)行工藝優(yōu)化，提高生產(chǎn)指標(biāo)，降低成本。并且卷曲霉素原液中相關(guān)單雜的增加會(huì)直接影響卷曲霉素成品中有效組分的含量，降低產(chǎn)品的等級(jí)，影響銷(xiāo)售價(jià)格，減少產(chǎn)品利潤(rùn)。為了不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量，樹(shù)立良好的企業(yè)形象，增加企業(yè)利潤(rùn)，滿足客戶對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)日益提高的要求，我們把提高原液質(zhì)量作為發(fā)酵工段產(chǎn)品質(zhì)量提高研究的重點(diǎn)。針對(duì)相關(guān)雜質(zhì)主要為蛋白類(lèi)物質(zhì)的物化性質(zhì)和產(chǎn)生原因，我們通過(guò)發(fā)酵液酸化pH值和過(guò)濾溫度控制工藝優(yōu)化試驗(yàn)，總結(jié)出兩者與產(chǎn)品中雜質(zhì)含量的關(guān)系。

1材料與方法

1.1菌種

纏繞鏈霉菌由華北制藥華勝公司提供。

1.2 工藝簡(jiǎn)介

硫酸卷曲霉素發(fā)酵過(guò)程是以葡萄糖、淀粉、魚(yú)粉、磷酸鹽為主要碳、氮、磷源的液體培養(yǎng)基中，在27.5～32.5℃進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)，經(jīng)三級(jí)發(fā)酵生物合成卷曲霉素。發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，發(fā)酵液用草酸酸化、加熱，過(guò)濾除去大量不溶性菌絲體、堿性蛋白、鈣鎂離子、培養(yǎng)基殘?jiān)入s質(zhì)。再用液體氫氧化鈉中和。成為符合離子交換工藝要求的硫酸卷曲霉素原液。

1.3 高產(chǎn)菌株的誘變和選育

誘變育種是提高發(fā)酵水平的重要手段之一。其中，紫外線誘變法是微生物育種中最常用和比較有效的誘變法?？熘凶诱T變法，具有較大的電離密度，能更多地引起點(diǎn)突變和染色體畸變，已有較多在抗生素產(chǎn)生菌的誘變育種中獲得了明顯效果的報(bào)道。我們利用經(jīng)紫外線誘變后的高產(chǎn)突變株為出發(fā)菌株，快中子輻射后進(jìn)行二次篩選。其誘變致死率和營(yíng)養(yǎng)缺陷的誘發(fā)率均比單一誘變的要高。從中篩選出高產(chǎn)菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其搖瓶效價(jià)較出發(fā)菌株提高了15%左右，新菌株投入發(fā)酵生產(chǎn)使用后，較2014年年平均增長(zhǎng)8.2%，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 高產(chǎn)突變株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][傳代數(shù)

F1

F2

F3

F4

F5][JQ10-02

100.0

100.5

98.9

99.2

97.5][JQ1001

112.1

110.0

111.3

109.8

107.9][JQ100B

109.7

112.4

109.9

108.5

108.3][JQ10-05

110.3

110.8

110.7

108.6

108.6]

注：搖瓶效價(jià)相對(duì)出發(fā)菌株F1代按100.0計(jì)算。

如表格所示，該菌種具有良好的遺傳穩(wěn)定性；菌種工藝在經(jīng)過(guò)優(yōu)化之后，篩選出來(lái)高單位菌株，其菌株搖瓶效價(jià)平均達(dá)到10000 u/ml以上。相應(yīng)卷曲霉素的發(fā)酵單位有了顯著提高，新菌種應(yīng)用的發(fā)酵罐批次，平均發(fā)酵單位要比原菌種提高8.2%。成功的降低了卷曲霉素的生產(chǎn)成本。

1.4 革新過(guò)濾工藝，提高原液質(zhì)量

卷曲霉素過(guò)濾的工藝為：發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液用草酸將pH調(diào)制酸性，然后加入助濾劑，用蒸汽加熱至90℃。經(jīng)板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾，酸性濾液冷卻后用液體氫氧化鈉溶液調(diào)pH至堿性。取樣檢驗(yàn)合格后交提取工序。但是由于原先工藝比較粗狂，導(dǎo)致原液的雜質(zhì)含量一直較高，為此，針對(duì)相關(guān)雜質(zhì)主要為蛋白類(lèi)物質(zhì)的物化性質(zhì)和產(chǎn)生原因，我們通過(guò)發(fā)酵液酸化pH值和過(guò)濾溫度控制工藝優(yōu)化試驗(yàn)，總結(jié)出兩者與產(chǎn)品中雜質(zhì)含量的關(guān)系。如下表：

表2 加熱時(shí)間對(duì)過(guò)濾前原液的CAⅠ前雜質(zhì)的影響

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][加熱時(shí)間/h

CAⅠ前雜質(zhì)/%][2

0.01][3

0.05][4

0.10][5

0.23][6

0.39][7

0.50][8

0.78]

表3 pH值對(duì)過(guò)濾時(shí)間以及原液的CAⅠ前雜質(zhì)的影響

[＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&＼&][pH值

過(guò)濾時(shí)間/h

CAⅠ前雜質(zhì)/%][2.0

3

0.40][2.5

2

0.03][3.0

3

0.43][3.5

5

0.56][4.0

5

0.55][4.5

8

0.79][5.0

10

1.32]

由此可見(jiàn)，加熱時(shí)間越短，過(guò)濾前原液的CAⅠ前雜質(zhì)的產(chǎn)生就越低，過(guò)濾時(shí)間越短，其CAⅠ前雜質(zhì)的產(chǎn)生就越低，針對(duì)這個(gè)情況，一方面我們把發(fā)酵液酸化pH值控制在2.5左右，提高了過(guò)濾速度；另一方面我們對(duì)過(guò)濾設(shè)備進(jìn)行改造，在濾前罐與板框之間增加了一個(gè)管道加熱器和維持罐，把加熱的時(shí)間由原來(lái)的3～5小時(shí)減少到了2個(gè)小時(shí)，減少了CAⅠ前雜質(zhì)的產(chǎn)生，新工藝實(shí)施后，雖然增加了工作量，但是原液中雜質(zhì)含量明顯降低，質(zhì)量得到明顯提高，CAⅠ前雜質(zhì)含量均低于工藝要求的0.5%CAⅠ前雜質(zhì)的產(chǎn)生百分含量，其中有30批次的罐原液CAI前雜質(zhì)為0，占到總原液罐數(shù)的77.8%，成品分子質(zhì)量合格率為100%，成品分子生物效價(jià)比2013年提高了10.2個(gè)百分點(diǎn)，在2014年鞏固期，只有1罐原液CAI前雜質(zhì)為0.3%，其余原液CAI前雜質(zhì)均為0，原液質(zhì)量得到進(jìn)一步提升，成品分子質(zhì)量也全部合格。

2 結(jié)論

①通過(guò)紫外線和快中子誘變法篩選后，從中篩選出高產(chǎn)菌株JQ1001、JQ100B和JQ10-05，其搖瓶效價(jià)較出發(fā)菌株提高了15%左右，新菌株投入發(fā)酵生產(chǎn)使用后，較2014年平均增長(zhǎng)8.2%。并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

②優(yōu)化了現(xiàn)有的過(guò)濾工藝，確定了發(fā)酵液酸化pH值、對(duì)過(guò)濾設(shè)備進(jìn)行了改造，優(yōu)化了過(guò)濾溫度控制工藝，降低了原液中雜質(zhì)的含量，提高了原液質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1]耿予歡，李國(guó)基，姚汝華，等.鏈霉素發(fā)酵的代謝調(diào)控育種及研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，文章篇號(hào)：1007-2764（2006）04-0244-082.

作者簡(jiǎn)介：方媛，女，漢，河北保定人，供職于華北制藥股份有限公司新制劑分廠，學(xué)士學(xué)位，研究方向：生物技術(shù)。