孟 霞， 謝世紅， 謝世濤， 徐節(jié)華， 劉文珍， 花 麒

(江西省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，江西南昌 330000)

激素類藥物主要包括雌激素、雄激素、孕激素及糖皮質(zhì)激素等，因其具有影響動物性別分化，提高動物源性產(chǎn)品的產(chǎn)量、縮短動物生長周期的作用，會被非法用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中以提高水產(chǎn)品的養(yǎng)殖效率[1 - 4]。激素類藥物一般較穩(wěn)定，不易降解，通過食物鏈進(jìn)入人體后，仍具有較強(qiáng)的生物活性及潛在的致癌性[5]。因此，歐盟、國際食品法典委員會(CAC)、美國、日本等均對動物源性食品中激素的殘留有嚴(yán)格要求[6]。我國農(nóng)業(yè)部176號、193號公告明確規(guī)定，禁止飼料和動物飲用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌激素，炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，及苯丙酸諾龍等雄激素和蛋白同化激素；235號公告規(guī)定己烯雌酚、乙酸甲羥孕酮、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍、甲基睪酮等激素在動物源性食品中不得檢出[7]。為了保證黃鱔的食用安全，開展黃鱔中激素的多組分同時監(jiān)控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，激素類物質(zhì)的測定方法主要有液相色譜法(LC)[8，9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10]、酶聯(lián)免疫法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12]等。對黃鱔中性激素多殘留測定方法的研究則只見于GC-MS[10]，未見有LC-MS/MS檢測方法的研究報道。為有效去除黃鱔肌肉組織的復(fù)雜基質(zhì)和提高提取率，本研究將樣品經(jīng)酶解乙酸乙酯提取后，采取冷凍離心的凈化方式去除蛋白和脂肪，建立了LC-MS/MS同時測定黃鱔肌肉組織中苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇、丙酸睪硐、乙酸炔諾硐、左炔諾硐、甲睪硐6種激素類藥物殘留的方法，為黃鱔中多種激素殘留的定性定量分析提供技術(shù)支撐和方法借鑒。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260-6420 UPLC-QQQ型液相色譜-質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；G-560E型渦旋混合器(美國，Scientific Industries 公司)；KQ-500B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；T25高速勻漿機(jī)(廣州儀科儀器有限公司)；KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳儀器有限公司)。

6種標(biāo)準(zhǔn)品：苯丙酸諾龍(Nandrolone Phenylpropionate)、苯甲酸雌二醇(Estradiol Benzoate)、丙酸睪酮(Testosterone Propionate)、乙酸炔諾酮(Norethindrone Acetate)、左炔諾酮(Levonorgestrel)、甲睪酮(Methyltestosterone)，純度均大于98.0%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。準(zhǔn)確稱取適量的以上6種激素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成1 mg/mL 的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，以及10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃冰箱中保存。將上述單個標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別用甲醇逐級稀釋成1 μg/mL的單個標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用于優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶復(fù)合酶，甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸銨、乙酸均為色譜純，無水乙酸鈉為分析純。實(shí)驗用水為超純水。

1.2 試樣的制備及前處理

取黃鱔肌肉約300 g用組織搗碎機(jī)搗碎，均質(zhì)備用。稱取5 g 均質(zhì)試樣(精確至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.2 mol/L NaAc緩沖溶液(pH=5.2)，以14 000 r/min均質(zhì)30 s，再加入30 μLβ葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶復(fù)合酶，混勻30 s，置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中酶解16 h。取出冷卻至室溫，加入15 mL乙酸乙酯，混勻1 min，常溫下以4 000 r/min離心10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，下層殘渣再以15 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并上層有機(jī)相至上述50 mL離心管中，于40 ℃氮吹至近干。加入2 mL乙腈-水溶液(體積比1∶1)超聲溶解殘渣，于-20 ℃冰箱冷凍1 h，取出于12 000 r/min下冷凍離心10 min，取適量上清液過0.22 μm針頭濾膜至樣品瓶中，供LC-MS/MS測定。

1.3 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

空白試樣按1.2節(jié)方法處理。取適量空白樣品提取液，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液混勻，配制成系列濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1色譜條件Agilent SB -C18色譜柱(50×2.1 mm， 1.8 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A相為乙腈，B相為水溶液(10%甲醇+0.3%乙酸+0.2%甲酸銨)；梯度洗脫程序：0.0～0.5 min，70%B;0.5～3.0 min，70%B～10%B;3.0～12.0 min，10%B;12.0～12.1 min，10%B～70%B;12.1～18.0 min，70%B。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饧捌渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化氣壓力：15.0 psi；毛細(xì)管電壓：4 000 V。6種激素類化合物的定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6種激素類化合物的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative icon.

1.5 定性和定量分析

在正離子模式的測定條件下，分別將樣品溶液和基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS/MS測定，以其基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時間和2對質(zhì)譜監(jiān)測離子對為依據(jù)進(jìn)行定性，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法以定量離子對的峰面積進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+離子模式下，6種激素類化合物因含有羰基等多電子基團(tuán)都可形成穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，做相應(yīng)化合物的選擇離子監(jiān)測(SIM)，優(yōu)化其碎裂電壓(Fragmentor)及毛細(xì)管電壓，使[M+H]+母離子的傳輸效率最大，然后對母離子做子離子全掃描(Product Icon Scan)，獲得碎片離子信息，同時結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子掃描圖，選擇受基質(zhì)影響較小且豐度較高的2個特征碎片離子分別作為定性與定量離子，優(yōu)化碰撞能量使其響應(yīng)最大，最后得到各化合物的定性定量離子對及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

6種激素類化合物都屬于弱極性化合物，在反相C18固定相中有較好的保留。本實(shí)驗選擇Agilent SB-C18色譜柱作為分離柱，正離子模式下在流動相B相的水溶液中加入0.3%乙酸有利于化合物的離子化，改善峰形，并提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。在流動相B相的水溶液中加入10%甲醇和0.2%甲酸銨溶液可以促進(jìn)離子化效率?；谝合嗌V分離的特點(diǎn)和要求，在優(yōu)化的流動相條件下，通過1.4.1項的梯度洗脫實(shí)現(xiàn)6種激素類藥物的快速分離，且峰形良好。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)采用不同的溶劑作為樣品處理后的復(fù)溶溶液會對質(zhì)譜響應(yīng)及色譜峰形產(chǎn)生顯著影響。6種激素屬于脂溶性化合物，弱極性，不溶于水，經(jīng)多次試驗，確定以50%乙腈-水溶液作為樣品處理后的復(fù)溶溶液，可獲得對稱、尖銳的峰形和良好的質(zhì)譜響應(yīng)。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

激素經(jīng)動物體吸收后會與基質(zhì)中的蛋白質(zhì)結(jié)合，以葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)形式存在,因此對試樣進(jìn)行酶解、酸或堿水解十分必要。較之酸水解和堿水解的劇烈性，酶解更溫和徹底。本實(shí)驗采用β葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶復(fù)合酶制劑對試樣中的結(jié)合態(tài)激素進(jìn)行酶解釋放，以提高檢測的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇、乙腈難于濃縮且提取回收率并不比乙酸乙酯和叔丁基甲醚的提取回收率高，而叔丁基甲醚易與緩沖溶液發(fā)生乳化提取效果不佳，因此本實(shí)驗選擇了提取回收率相對較高且易于濃縮的乙酸乙酯作為提取溶劑。

6種激素均屬于弱極性的脂溶性化合物，在正己烷中有一定的溶解度，直接用正己烷去脂時會出現(xiàn)部分損失。本實(shí)驗還選用了反相的C18和HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化試驗，但樣品提取液會堵塞兩種固相萃取柱，都不能有效地去除干擾，且降低了回收率。由于LC-MS/MS本身具有較強(qiáng)的抗干擾能力，故本方法采用低溫脫脂的凈化方式，可獲得背景信號較低的MRM離子流色譜圖。

基質(zhì)效應(yīng)是指當(dāng)色譜分離時共洗脫的物質(zhì)改變了待測組分的離子化效率，所引起信號的提高或抑制。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響大時，會降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性。由于黃鱔中的蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，其它各種內(nèi)源性雜質(zhì)也很多，在進(jìn)行激素類藥物的LC-MS/MS檢測時會有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本實(shí)驗采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法進(jìn)行外標(biāo)定量分析。以空白試樣的提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，為標(biāo)準(zhǔn)溶液提供與樣品溶液相似的離子化環(huán)境，從而消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 線性范圍與檢出限

在0.5～100 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮、乙酸炔諾酮、左炔諾酮及甲睪酮等6種激素類藥物的線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。采用空白樣品添加低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按方法規(guī)定進(jìn)行前處理，然后上機(jī)測定，以3倍信噪比作為檢出限(LOD),10倍信噪比作為定量限(LOQ)，黃鱔肌肉中苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮、乙酸炔諾酮、左炔諾酮及甲睪酮LOD為0.25～1.0 μg/kg，LOQ為 0.5～2.0 μg/kg，結(jié)果見表2。

2.5 準(zhǔn)確度與精密度

向空白試樣中添加6個濃度水平的6種激素類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前述處理方法及測定條件進(jìn)行回收率實(shí)驗，每個添加水平做6個平行，結(jié)果見表3。各化合物的平均回收率為70.5%～107.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.9%～9.5%，均符合殘留檢測有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求。

2.6 實(shí)際樣品測定

采用本方法對江西市場及產(chǎn)地54批次樣品進(jìn)行測定，均未檢出6種激素類藥物殘留。

表2 6種激素類藥物的線性方程、檢出限和定量限(n=6)

表3 6種激素類化合物在黃鱔肌肉組織中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定黃鱔肌肉組織中苯丙酸諾龍、苯甲酸雌二醇、丙酸睪酮、乙酸炔諾酮、左炔諾酮、甲睪酮等6種激素類藥物殘留的方法。在優(yōu)化的實(shí)驗條件下，6種激素用Agilent SB-C18色譜柱分離后，在LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性及定量分析。該方法試樣的前處理簡單快速，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度好，適用于黃鱔等蛋白脂肪含量高的動物組織中激素類藥物多殘留的同時測定。