尹燕敏， 沈穎青， 朱月芳， 秦宏兵

(1.蘇州市環(huán)境監(jiān)測中心,江蘇蘇州 215004;2.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇南京 210036)

抗生素是人們接觸最為頻繁、用量最大的一類藥物，其環(huán)境行為和效應(yīng)已受到關(guān)注[1]。該類藥物通過多種途徑進(jìn)入環(huán)境后，可抑制環(huán)境中有益微生物的活性，刺激病原菌產(chǎn)生抗藥性，從而對陸生或水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)[2]。環(huán)境中的抗生素長期存在可直接影響到飲用水的安全，并通過食物鏈潛在影響人體健康。進(jìn)入水環(huán)境中的抗生素不僅種類繁多，且多以ng/L級的低濃度存在[3，4]，而沉積物則基體復(fù)雜。因此，急需水環(huán)境及沉積物中抗生素殘留靈敏、準(zhǔn)確、快速的分析方法，為抗生素環(huán)境行為(分布、遷移轉(zhuǎn)化、降解動態(tài)、生物富集)和生態(tài)效應(yīng)的研究提供必要的技術(shù)手段。

迄今為止，國內(nèi)對環(huán)境中抗生素的報道多為分析方法研究[5 - 10]，對于污染水平研究還很欠缺，也沒有一個國家標(biāo)準(zhǔn)方法可以參照。本研究結(jié)合實際情況，將固相萃取(SPE)及加速溶劑萃取技術(shù)(ASE)與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)相結(jié)合，建立水和底泥中20種常見抗生素的分析方法，通過優(yōu)化樣品分離、富集和凈化等前處理條件，以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等相關(guān)參數(shù)，建立靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高的痕量藥物檢測方法。運用建立的方法調(diào)查蘇州市地表水及底泥樣品中20種目標(biāo)藥物殘留狀況，并進(jìn)行結(jié)果分析，為后續(xù)研究提供技術(shù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

UPLC-XEVO-TQMS超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Waters公司)；Caliper Autotrace SPE(6位)；Dionex ASE-300型加速溶劑萃取儀 (美國)，配34 mL 和66 mL萃取池；EYELA MG-2200氮吹儀。

磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺-2-甲基嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嗪、磺胺乙酰、磺胺噻唑、磺胺吡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲異惡唑、磺胺喹惡啉、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、甲砜霉素、氟甲砜霉素及氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，均購于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(Merck公司)；氫氧化鈉、乙酸銨為優(yōu)級純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 樣品處理

1.2.1地表水樣品水樣前處理采用固相萃取。固相萃取小柱依次用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇、6 mL甲酸溶液(pH=3)進(jìn)行活化。水樣經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后取500 mL水樣，加入0.5 g EDTA，調(diào)pH后過小柱，富集完成后用10 mL水淋洗，氮吹20 min，用12 mL洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液氮氣吹至近干后用初始流動相定容至1 mL，過0.2 μm膜后，進(jìn)樣分析。

1.2.2沉積物樣品沉積物樣品處理采用加速溶劑萃取。取5 g新鮮底泥樣品冷凍干燥后加入無水硫酸鈉，再加入1 g弗羅里硅土，混勻后裝入66 mL的萃取池中。所用溶劑為乙腈與乙酸乙酯(1∶1，V/V)，溫度80 ℃，壓力1 500 psi，預(yù)熱5 min，靜態(tài)提取5 min，重復(fù)2次，用40 mL溶劑快速沖洗樣品，氮氣吹掃收集全部提取液后，將其吹至近干，初始流動相定容至1 mL，過0.2 μm膜后，進(jìn)樣分析。

1.3 儀器條件

色譜條件：UPLC BEH C18色譜柱(50×2.1 mm,1.7 μm);流動相:10 mmol/L乙酸銨(0.01%甲酸)(A相)和乙腈(B相)，流速為0.4 mL/min。梯度條件：0 min，95%A；7.0 min，80%A；7.5 min，80%A；8 min，0%A；8.5 min，95%A。柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；霧化氣、脫溶劑氣、錐孔氣為氮氣，碰撞氣為氬氣；源溫度和脫溶劑氣溫度分別為150 ℃和500 ℃ ；脫溶劑流速和錐孔氣流速分別為1 000和50 L/h；毛細(xì)管電壓為3.5 kV。檢測方式為MRM模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對目標(biāo)化合物進(jìn)行分析?；前奉惣班Z酮類抗生素在正離子模式下，全掃描的分子離子[M+H]+最理想，而氯霉素類在負(fù)離子模式下的分子離子[M-H]-理想，因此對于兩類目標(biāo)化合物分別選用[M+H]+及[M-H]-作碰撞誘導(dǎo)解離的母離子。在MS/MS模式下，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞電壓、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件

2.2 色譜條件優(yōu)化

用液相色譜-質(zhì)譜法分析磺胺類及喹諾酮抗生素常用的流動相為甲酸水溶液與乙腈或甲醇按比例混合。但是氯霉素類抗生素采用ESI-模式測定，酸的加入影響ESI-的靈敏度。傳統(tǒng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用采用ESI-分析時，流動相中適當(dāng)加入銨鹽可改善目標(biāo)分析物的電離情況，增強ESI-的靈敏度。當(dāng)水相中同時添加乙酸銨和甲酸時，有利于目標(biāo)分析物的分子離子化，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形得到極大改善。

本實驗考察了以乙腈-10 mmol/L乙酸銨(分別含0、0.01%、0.02%、0.05%和0.1%甲酸)作為流動相對目標(biāo)化合物的影響。結(jié)果表明在甲酸含量為0時，喹諾酮類無法洗脫，隨著甲酸濃度增加，目標(biāo)化合物的響應(yīng)有所下降，同時峰形展寬。根據(jù)峰形、響應(yīng)強度及分離度等因素，綜合考慮選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨(0.01%甲酸)為流動相。

2.3 地表水樣品前處理優(yōu)化

影響固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱類型、樣品pH、上樣速度等，采用空白加標(biāo)對上述因素進(jìn)行優(yōu)化。實驗分別考察了HLB柱和普通C18柱對目標(biāo)化合物的萃取效果，研究發(fā)現(xiàn)HLB柱對目標(biāo)化合物的萃取效率高于C18柱。因此，本文采用HLB柱對樣品進(jìn)行富集和凈化。比較了樣品pH為3和7的空白加標(biāo)水樣的提取效率。發(fā)現(xiàn)pH為3時的提取效率優(yōu)于pH為7的效率，因此水樣用1 mol/L H2SO4調(diào)至pH等于3。實際水樣中通常含有一定量的金屬離子，易與抗生素螯合，給提取帶來困難，利用EDTA能有效降低抗生素與金屬離子的螯合。以Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+做干擾試驗，發(fā)現(xiàn)有上述離子存在時，目標(biāo)化合物的回收率為11.4%～59.6%；加入EDTA后，回收率為68.4%～92.1%，且結(jié)果相對穩(wěn)定，所以本實驗中加入EDTA以絡(luò)合部分金屬離子。分別用甲醇、乙腈和酸化的甲醇(0.01%甲酸)作為洗脫液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)使用甲醇和乙腈洗脫效率低于酸化的甲醇，因此，洗脫液采用含0.01%甲酸的甲醇溶液。上樣流速分別為5、10 mL/min時，空白加標(biāo)的回收率沒有顯著差異，選擇上樣速率為10 mL/min。

2.4 沉積物樣品前處理優(yōu)化

首先，準(zhǔn)確稱取5.0 g底泥樣品，置于50 mL離心管中。加入10 mL乙腈/水(25∶75,V/V)溶液(用稀氨水調(diào)節(jié)至pH=10)，渦旋1 min，超聲提取15 min后，4 ℃離心10 min(4 500 r/min)。取出上清液，殘渣再加入10 mL提取溶液，重復(fù)上述步驟。但是由于離心效果不好，無法實現(xiàn)分離。因此，采用加速溶劑萃取處理沉積物樣品。選用甲醇/乙酸乙酯(1∶1,V/V)，甲醇/丙酮(1∶1,V/V)，乙腈作為提取劑考察提取效率。發(fā)現(xiàn)以甲醇/乙酸乙酯作為提取劑時，喹諾酮類和氯霉素類的提取效率滿意，而磺胺類的提取效率介于12.5%～60.3%；采用甲醇/丙酮作為提取劑時，氯霉素類的提取效率滿意，而磺胺類的16.4%～66.4%，喹諾酮類的提取效率介于16.4%～37.1%；采用乙腈作為提取劑時，大部分磺胺類的提取效率滿意，氯霉素類的提取效率滿意，而喹諾酮類的提取效率介于18.7%～30.9%。采用乙腈與乙酸乙酯混合作為提取溶劑，優(yōu)化乙腈與乙酸乙酯的比例，選擇乙腈與乙酸乙酯比例分別為5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1時，發(fā)現(xiàn)隨著乙酸乙酯的比例增加喹諾酮類的回收率逐漸增加，而磺胺類的回收率逐漸下降，而氯霉素類的回收率則影響不大。綜合考慮，最終選擇乙腈與乙酸乙酯的比例為8∶2。

在其它萃取條件不變的情況下，選擇60、70、80、100 ℃ 4個提取溫度進(jìn)行研究，結(jié)果表明提取溫度對樣品加標(biāo)回收率的影響很大。當(dāng)提取溫度超過60 ℃，大部分化合物的加標(biāo)回收率明顯提高，但當(dāng)溫度超過80 ℃時提取雜質(zhì)增多，結(jié)果重復(fù)性差。與60、70、100 ℃時相比，80 ℃的提取效果較好，除磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺氯噠嗪外，樣品的加標(biāo)回收率均在40%～130%之間。這可能是由于隨著溫度的升高，溶劑的粘度下降，從而加強了溶劑浸潤基質(zhì)和溶解目標(biāo)分析物的能力。加入的熱能同時也有助于破壞目標(biāo)化合物與基質(zhì)之間的作用力，增強目標(biāo)分析物從基質(zhì)表面擴散到溶劑中的能力，從而提高萃取回收率。但隨著溫度進(jìn)一步提高，可能促進(jìn)了部分抗生素的分解，導(dǎo)致回收率降低，所以實驗選擇最佳提取溫度為80 ℃。

2.5 方法線性范圍和檢出限

將抗生素儲備液(1 000 mg/L)用初始流動相稀釋為0.5～50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照1.3節(jié)的儀器條件進(jìn)行分析。以定量離子對的響應(yīng)面積(Y)和對應(yīng)濃度(X)進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N≥3)估算方法檢出限，水樣和沉積物中20種目標(biāo)化合物的方法檢出限分別為0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之間，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等見表2。

表2 目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限

2.6 方法精密度及加標(biāo)回收率

取空白水樣，分別制得濃度為4.0、40.0和100 ng/L加標(biāo)水平的加標(biāo)樣品，按照1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，外標(biāo)法定量計算，每個濃度水平重復(fù)測定6次，得到添加濃度水平為4.0～100 ng/L時，各目標(biāo)化合物的平均回收率在68.0%～132%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.27%～16.0%；取空白土壤樣品，分別制得濃度為1.0，10.0和50.0 μg/kg加標(biāo)水平的加標(biāo)樣品，按照1.2節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，外標(biāo)法定量計算，每個濃度水平重復(fù)測定6次，得到添加濃度水平為1.0～50.0 μg/kg時，各目標(biāo)化合物的平均回收率在45.3%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.94%～20.5%，結(jié)果顯示了較好的回收率與精密度，可滿足地表水和沉積物中抗生素檢測的要求。

2.7 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對蘇州地區(qū)東太湖流域、陽澄湖及京杭大運河蘇州段等不同來源20余個點位的地表水及底泥樣品進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，對于地表水樣品，共有磺胺乙酰、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星10種抗生素檢出，濃度范圍為0.79～240 ng/L，其中檢出濃度最高的是磺胺類抗生素磺胺鄰二甲氧嘧啶，檢出率最高的是氟甲砜霉素，檢出率為100%；對于沉積物樣品，共有磺胺嘧啶、磺胺-5-甲氧基嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、甲砜霉素、氟甲砜霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星11種抗生素檢出，濃度范圍為0.37～27.0 μg/kg，其中檢出濃度最高的是磺胺類抗生素磺胺鄰二甲氧嘧啶，檢出率最高的是氟甲砜霉素，檢出率為100%。在所有樣品中，各個監(jiān)測點都有不同濃度和組成的藥物殘留，表明了這些藥物在生產(chǎn)、消費、處方和使用等模式上的區(qū)域差異，與其他藥物相比，檢出比例達(dá)80%以上的抗生素是磺胺類藥物磺胺甲基異惡唑及氯霉素類藥物甲砜霉素和氟甲砜霉素。證明了此類藥物的廣泛使用。

3 結(jié)論

建立了水樣和沉積物樣品中喹諾酮和磺胺類抗生素的超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。該方法在9 min 內(nèi)完成對20種目標(biāo)化合物的分析，對于水樣和沉積物樣品的方法檢出限分別在0.01～0.50 ng/L和0.005～0.2 μg/kg之間，外標(biāo)法定量準(zhǔn)確性較好，地表水和相應(yīng)的沉積物測定結(jié)果表明地表水和沉積物中已經(jīng)受到抗生素污染。