薛芝敏， 付鳳富

(1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建福州 350001； 2.福州大學(xué)食品安全分析與檢測(cè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 3501116)

苯甲酰脲類農(nóng)藥具有低劑量、低環(huán)境持久性、易生物降解和對(duì)哺乳動(dòng)物低毒等特點(diǎn)，越來(lái)越多地被用于作物病蟲(chóng)害的控制[1，2]。苯甲酰脲類農(nóng)藥雖然對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性相對(duì)較低，但植物中的苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留仍可通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康造成傷害。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)已將一些苯甲酰脲類農(nóng)藥歸類為毒性Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)的中等毒性物質(zhì)[3]。目前，許多國(guó)家都已規(guī)定了針對(duì)茶葉的有關(guān)苯甲酰脲類農(nóng)藥的最大殘留限量值(MRL)。我國(guó)有關(guān)茶葉中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的研究報(bào)道還較少，但國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2012)規(guī)定茶葉中除蟲(chóng)脲的最大殘留限量為20 mg/kg。目前，檢測(cè)機(jī)構(gòu)主要通過(guò)檢測(cè)成品茶葉中的農(nóng)藥殘留。但茶葉是一種飲料，許多研究表明，茶湯中農(nóng)藥殘留不僅取決于成品茶中的農(nóng)藥殘留，也取決于農(nóng)藥的溶出特性[4，5]。因此，研究同時(shí)檢測(cè)茶湯中多種苯甲酰脲類農(nóng)藥的高靈敏和快速分析方法具有十分重要的意義。

迄今為止，有關(guān)苯甲酰脲類農(nóng)藥的分析檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，并已被廣泛應(yīng)用于食品中苯甲酰脲類農(nóng)藥的測(cè)定[6 - 12]。然而，有關(guān)茶湯中多種苯甲酰脲類農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)的研究報(bào)道還比較少見(jiàn)[4，5]。本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)，結(jié)合溶劑提取和固相萃取，同時(shí)分析檢測(cè)茶湯中氟啶脲、除蟲(chóng)脲、啶蜱脲、伏蟲(chóng)隆、氟鈴脲、氟蟲(chóng)脲和殺鈴脲7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的分析方法，以期為更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)茶葉的消費(fèi)安全提供方法支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及工作條件

安捷倫1290/6410 HPLC-MS/MS儀(美國(guó)，安捷公司)，配置安捷倫Zorbax SB-C18高效色譜柱。流動(dòng)相為2 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇，按下面程序進(jìn)行梯度洗脫：70%(V/V)的甲醇在7 min內(nèi)線性增加到100%的甲醇，然后在0.5 min內(nèi)線性降至70%的甲醇并保持3 min。流動(dòng)相的流速為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃。質(zhì)譜儀配備電噴霧離子源(ESI)，采用負(fù)離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。離子源電壓為±4 kV，離子源溫度為300 ℃，霧化壓力為50 psi，干燥氣體(N2)流量為8.0 L/min，干燥氣的溫度為350 ℃，采用完整MS2掃描方式在m/z100～550范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。用于每種苯甲酰脲類農(nóng)藥檢測(cè)的離子以及其分子式和分子量如表1所示。

表1 7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的分子式、母體離子和用于HPLC-MS/MS測(cè)定的選擇性離子

1.2 試劑

7種苯甲酰脲類農(nóng)藥氟啶脲(CHLO)，除蟲(chóng)脲(DIFL)，啶蜱脲(FLUA)，氟蟲(chóng)脲(FLUF)，氟鈴脲(HEXA)，伏蟲(chóng)隆(TEFL)和殺鈴脲(TRIF)標(biāo)準(zhǔn)品均為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)，購(gòu)自北京振翔工貿(mào)有限責(zé)任公司。用甲醇稀釋、溶解以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制備100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在-5 ℃保存并在3個(gè)月內(nèi)使用。乙酸銨(色譜級(jí))為美國(guó)ROE公司生產(chǎn)，甲醇(色譜級(jí))為美國(guó)天地公司生產(chǎn)。弗羅里硅土(60～100目)購(gòu)自美國(guó)SUPELCO公司，活性炭(36～50目)購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥公司。實(shí)驗(yàn)中所用的水為Mili-Q水(18.2 MΩ·cm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)中所測(cè)定的茶葉由福建茶檢中心提供，已確認(rèn)含有苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留。茶葉的沖泡方法與日常消費(fèi)者的習(xí)慣泡茶方法相同。取約5 g的茶葉樣品，加入開(kāi)水110 mL浸泡2 min后，分離出茶湯溶液(第1次茶湯)。殘留茶葉再重復(fù)用110 mL沸水沖泡2次，每次沖泡的時(shí)間分別為3 min和5 min，得到第2次茶湯和第3次茶湯。茶湯冷卻后，用于7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的檢測(cè)。

首先，移取50 mL的茶湯到分液漏斗，加入15 mL二氯甲烷，充分振蕩萃取5 min，靜置后分離出有機(jī)相溶液。殘留的茶湯溶液用相同的方法再重復(fù)萃取1次，2次萃取的有機(jī)相溶液合并獲得總萃取溶液?？傒腿∪芤涸?5 ℃水浴條件下，用氮吹儀濃縮至約1 mL。然后，把濃縮后的二氯甲烷萃取液移入固相萃取小柱(6×1 cm i.d.填有0.50 g弗羅里硅土和0.05 g活性炭，預(yù)先用10 mL 25%的乙腈和75%甲苯混合溶液淋洗)。接著，用20 mL的乙腈和甲苯混合溶劑(1∶3,V/V)洗脫吸附在固相萃取小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥，并在45 ℃水浴條件下用氮吹儀將洗脫液吹至近干，殘留物重新用1 mL甲醇再次溶解，最終的甲醇溶液用于HPLC-MS/MS分析。同時(shí)，在另一組茶湯樣品中加入終濃度為1 ng/mL的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后按上述同樣的方法進(jìn)行萃取、預(yù)富集和測(cè)定以獲得回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的提取和前處理優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇考慮到本文研究的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的溶解性質(zhì)和提取溶劑的溶解度，二氯甲烷和乙酸乙酯被嘗試用于提取茶湯中的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二氯甲烷能有效提取全部7種苯甲酰脲類農(nóng)藥。因此，本文采用二氯甲烷作為提取溶劑。

提取溶劑與茶湯樣品的體積比是提取茶湯中所有苯甲酰脲類農(nóng)藥的另一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取溶劑體積與茶湯樣品體積的最佳比例為3∶10。比例太高將提高試劑空白的背景，損失了方法檢測(cè)限；而比例偏低，則提取效率較低，最終也導(dǎo)致方法靈敏度的降低。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響實(shí)驗(yàn)分別選擇提取時(shí)間1、2、5、7、10 min，考察提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明，提取時(shí)間在1～5 min內(nèi)，提取效率隨提取時(shí)間的增加而增加，但在5～10 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加提取效率基本上不再變化、達(dá)到最大值，所以選擇5 min為最佳提取時(shí)間。

在上述最佳提取溶劑/茶湯樣品體積比和提取時(shí)間下，經(jīng)過(guò)2次提取，茶湯中所有苯甲酰脲類農(nóng)藥的提取率可達(dá)90%以上。

2.1.3提取液預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化文獻(xiàn)報(bào)道活性炭可以有效去除茶葉提取液中的色素，而弗羅里硅土可以有效去除茶葉提取液中其他雜質(zhì)比如糖類、酯類等[13]。所以，在本實(shí)驗(yàn)中我們利用一根長(zhǎng)6 cm、內(nèi)徑1 cm的弗羅里硅土和活性炭固相萃取小柱對(duì)茶湯提取液中的苯甲酰脲類農(nóng)藥進(jìn)行預(yù)富集，并去除色素和糖類、酯類等干擾物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在長(zhǎng)6 cm、內(nèi)徑1 cm的小柱中填充0.5 g弗羅里硅土和0.05 g活性炭，可以去除茶湯提取液中大部分的色素、糖類和酯類等干擾物質(zhì)，并獲得滿意回收率。

圖1 7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的色譜圖Fig.1 The chromatograms of 7 benzoylurea pesticides(A)Mixed standards solution of 7 benzoylurea pesticides(10 ng/mL CHLO,100 ng/mL DIFL,20 ng/mL FLUA,100 ng/mL FLUF,5 ng/mL HEXA,20 ng/mL TEFL and 20 ng/mL TRIF);(B)Oolong tea infusion;(C)Green tea infusion;(D)blank.

根據(jù)7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的極性，乙腈和甲苯的混合物被用于洗脫吸附在活性炭/弗羅里硅土固相小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥。通過(guò)使用不同體積比的乙腈和甲苯混合液(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)為溶劑對(duì)乙腈和甲苯的比例進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明乙腈/甲苯(V/V)=1/3是最好的選擇。利用20 mL乙腈和甲苯混合溶劑可以把吸附在活性炭/弗羅里硅土固相小柱上的苯甲酰脲類農(nóng)藥完全洗脫下來(lái)。

2.2 方法線性范圍、重現(xiàn)性和檢測(cè)限

樣品經(jīng)上述提取和預(yù)處理后，利用HPLC-MS/MS對(duì)烏龍茶和綠茶茶湯樣品中的7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的濃度進(jìn)行了測(cè)定，其色譜圖如圖1所示。可以清楚地觀察到7種苯甲酰脲類農(nóng)藥在6.5 min內(nèi)被完全分離，基本沒(méi)有基質(zhì)干擾。繪制了校準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明氟啶脲在0.25～10 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，除蟲(chóng)脲和氟蟲(chóng)脲在5.0～250 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，啶脾脲、氟苯脲和殺鈴脲在0.5～20 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，氟鈴脲在0.13～5.0 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，其色譜峰鋒面積和濃度呈良好的線性關(guān)系。其線性方程、檢測(cè)限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見(jiàn)表2。從表2可知，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的檢測(cè)限(DL)和定量限(QL)分別為0.08～1.00 ng/mL和0.09～3.02 ng/mL。6次重復(fù)測(cè)定的RSD小于8%(n=6)。

表2 方法線性回歸方程、線性范圍、重現(xiàn)性、檢測(cè)限和定量限

aX=concentration(ng/mL),Y=counts(peak area);bInstrument detection limit(IUPAC criterion);cIUPAC criterion;dEURACHEM criterion(RSD,10%).

2.3 茶湯樣品的測(cè)定

7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的測(cè)定結(jié)果和回收率見(jiàn)表3和表4。從表3、4和圖1，可以發(fā)現(xiàn)茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)基線分離，沒(méi)有明顯的基質(zhì)干擾，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在90%～105%之間，5次重復(fù)測(cè)定的RSD小于7.0%，說(shuō)明了方法的可靠性。

表3 烏龍茶湯中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果(n=5)

表4 綠茶茶湯中苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

建立了一種基于HPLC-MS/MS法，結(jié)合溶劑提取和固相富集技術(shù)同時(shí)分析檢測(cè)茶湯中7種苯甲酰脲類農(nóng)藥殘留的分析方法。在最佳條件下，7種苯甲酰脲類農(nóng)藥在6.5 min內(nèi)被完全分離，沒(méi)有明顯的基質(zhì)干擾。該方法具有耗時(shí)短、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，有助于茶葉安全飲用的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。