滕娜等

[摘要] 目的 探討吸入氫氣（H2）對膿毒血癥大鼠急性肺損傷的影響。 方法 選取雄性SD大鼠40只，體重200～250 g。采用隨機數(shù)字表法將其分為4組（n = 10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1% H2組和2% H2組。采用CLP法制備膿毒血癥模型。1% H2組與2% H2組于CLP術(shù)后12 h分別吸入1% H2與2% H2 2 h。結(jié)束后，采集股動脈血樣行血氣分析，計算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；測定血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細胞介素-6（IL-6）水平；隨后處死大鼠取肺組織，檢測肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）、核因子-кB（NF-κB）、髓過氧化物酶（MPO）活性；光鏡下觀察肺組織病理改變。 結(jié)果 與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2降低，血漿中HMGB1、IL-6水平升高，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平升高，病理學損傷明顯加重（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2升高，血漿中HMGB1、IL-6水平降低，肺組織TLR-4、NF-κB、MPO水平降低，病理學損傷也減輕（P < 0.05），1% H2組和2% H2組上述各指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 吸入H2能夠減輕膿毒血癥引起的急性肺損傷，其機制可能與抑制炎性反應有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 氫氣；膿毒血癥；大鼠；肺損傷

[中圖分類號] R631 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（a）-0008-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of hydrogen （H2） inhalation on acute lung injury in rats with sepsis. Methods Forty healthy male SD rats （weighing 200-250 g） were randomly divided into 4 groups （n = 10） using a random number table： sham operation group （SH group）， cecal ligation and puncture group （CLP group）， 1% H2 group， 2% H2 group respectively. Sepsis model was produced by CLP. 1% H2 and 2% H2 group received 2 h inhalation of 1% H2 and 2% H2 at 12 h after CLP， respectively. At the end of hydrogen inhalation， blood samples were obtained for blood gas analysis. PaO2/FiO2 was calculated and the levels of high mobility group protein 1 （HMGB1）， interleukin-6 （IL-6） were determined. The rats were then sacrificed and lungs were immediately removed for determination of the activity of Toll-like receptors-4 （TLR-4）， nuclear factor kappa B （NF-κB） and myeloperoxidase （MPO）； pathology assessment of lung was done under light microscope. Results Compared with SH group， PaO2/FiO2 was significantly decreased， plasma levels of HMGB1， IL-6 increased， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs increased， and the pathological injury was significantly aggravated in CLP group， 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. Compared with CLP group， PaO2/FiO2 increased significantly， levels of HMGB1， IL-6 in plasma decreased markedly， levels of TLR-4， NF-κB， MPO in lungs decreased， and the pathological injury was reduced in 1% H2 group and 2% H2 group （P < 0.05）. There were no significant differences of the above indexes between 1% H2 group and 2% H2 group （P > 0.05）. Conclusion Hydrogen inhalation can alleviate sepsis induced ALI in rats， and its mechanism may be related to inhibiting inflammatory response.

[Key words] Hydrogen； Sepsis； Rat； Lung injury

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種以急性肺部炎癥及肺泡毛細血管屏障功能損傷為主要特征的危及生命的臨床綜合征。膿毒血癥是引起ALI最主要原因之一[1-2]，目前尚沒有有效的藥物治療措施。研究表明，氫氣（H2）或含有H2的溶液具有選擇性抗氧化、抗炎癥等臟器保護作用[3-6]。本研究探討吸入H2對大鼠膿毒血癥肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠[購自常州卡文斯實驗動物有限公司，批號為SCXK（蘇）2011-0003]40只，SPF級，體重200～250 g，采用隨機數(shù)字表法將其分為4組（n = 10）：假手術(shù)組（SH組）、盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP組）、1% H2組和2% H2組。

1.2 動物模型制作

參照文獻[7]的方法建立CLP模型，沿大鼠腹正中線做一長為1 cm的切口，游離腸系膜和盲腸，用4-0絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，用18號針頭貫通穿刺盲腸結(jié)扎端，擠出少許糞便，后將盲腸還納至腹腔，逐層縫合腹壁切口。SH組僅剖腹，分離盲腸遠端，逐層關(guān)腹。

1.3 實驗方法

參照文獻[8]使用M177021H2發(fā)生器（北京中西遠大公司）提供H2，其純度為99.999%。將大鼠放入帶有進氣口和出氣口的密封箱子內(nèi)，將H2和空氣混合后從進氣口輸入箱內(nèi)，殘余氣體從出氣口收集。用泵吸式JSA8-H2高敏氫氣檢測儀（深圳吉順安科技有限公司）通過通氣管路調(diào)定吸入H2濃度。1% H2組和2% H2組于CLP術(shù)后12 h時分別吸入1%的H2和2%的H2 2 h，SH組與CLP組只放置于箱子內(nèi)，不吸入H2。

1.4 取材及處理方法

吸H2 2 h后，四組分別采集動脈血樣3 mL，1 mL用于進行血氣分析，采用i-STAT300型血氣分析儀（Abbott公司，美國），計算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）；另外2 mL，于4℃ 3000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血漿中高遷移率族蛋白1（HMGB1）、白細胞介素-6（IL-6）含量。隨后處死大鼠，取左肺組織勻漿，4℃ 10 000 r/min離心15 min，離心后取上清液，采用ELISA測定肺組織中Toll樣受體4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）含量（試劑盒購自于美國R&D公司）及髓過氧化物酶（MPO）活性（試劑盒購自南京建成科技有限公司）。嚴格按照說明書操作。取右肺組織，置于10%福爾馬林中固定、石蠟包埋、切片、HE染色，在光鏡下觀察肺組織病理改變情況并參照文獻[9]進行病理學損傷評分，1分：肺組織結(jié)構(gòu)正常；2分：肺間質(zhì)輕度充血和中性粒細胞浸潤；3分：肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，血管周圍水腫形成，中度中性粒細胞浸潤；4分：肺組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，大量中性粒細胞浸潤。隨機選擇10個非重疊視野進行評分，取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，采用LSD-t檢驗行兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠PaO2/FiO2及肺組織病理學評分比較

與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2降低，病理學損傷明顯加重（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組PaO2/FiO2升高，病理學損傷明顯減輕（P < 0.05）。1% H2組和2% H2組組間上述各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 四組大鼠各項生化指標比較

與SH組比較，CLP組、1% H2組、2% H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性明顯升高，血漿中HMGB1、IL-6水平增高（P < 0.05）。與CLP組比較，1% H2組、2% H2組肺組織TLR-4、NF-κB、MPO活性降低，血漿中HMGB1、IL-6水平降低（P < 0.05），1% H2組和2% H2組組間上述各指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

ALI是感染、休克及創(chuàng)傷等多種原因引起的嚴重的肺部病理性改變，進一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。據(jù)資料顯示，ALI/ARDS是重癥監(jiān)護病房內(nèi)患者死亡的主要原因之一[10]。目前只能采用支持治療，尚無根治性治療措施。目前的研究認為膿毒血癥是導致ALI/ARDS的重要原因，而CLP是誘發(fā)膿毒血癥的經(jīng)典方法，已廣泛用于實驗研究[11-13]。本研究采用CLP制備大鼠膿毒癥模型，術(shù)后10～12 h，大鼠開始出現(xiàn)活動減少、豎毛、蜷縮、呼吸急促等；同時，研究結(jié)果表明，炎癥因子水平明顯增高，提示膿毒血癥模型制備成功；CLP后PaO2/FiO2降低，肺組織病理學損傷評分升高，提示膿毒血癥誘發(fā)ALI的模型制備成功；而吸入H2后PaO2/FiO2升高，肺組織病理學損傷評分降低，提示吸入H2可以減輕大鼠膿毒血癥誘發(fā)的ALI。

中性粒細胞浸潤是引起ALI的重要原因之一[14-15]。肺組織中性粒細胞的浸潤和激活在一定程度上決定了ALI的程度，大量中性粒細胞黏附聚集于肺組織毛細血管內(nèi)，與血管內(nèi)皮細胞相互作用，可導致肺損傷；中性粒細胞活化后透過呼吸暴發(fā)及脫顆粒作用，加重肺組織損傷[16]。MPO作為中性粒細胞的特異性酶，其活性可反映中性粒細胞的聚集浸潤程度[17]。本研究結(jié)果提示，與CLP組比較，吸入H2組MPO活性降低，表明H2通過抑制組織中的MPO浸潤從而減輕炎性反應。

TLR-4是誘導炎性反應的門戶蛋白，研究提示它在多種病理反應中起重要作用[18-19]。CLP產(chǎn)生的內(nèi)毒素刺激機體釋放大量的HMGB1釋放入血[20]，HMGB1作為TLR-4的內(nèi)源性配體，可激活TLR-4信號通路，通過多種途徑使NF-кB活化，從而導致炎癥細胞因子IL-6的釋放[21]。本研究結(jié)果表明CLP導致肺組織中的TLR-4、HMGB1、NF-кB的表達增加，血漿中的IL-6水平上升。吸入H2可以降低TLR-4、HMGB1、NF-кB及血漿中的IL-6水平。

H2無色無味，含量非常豐富。作為一種抗氧化物質(zhì)，H2具有準備簡單、無毒、無殘留等優(yōu)點，同時大量的研究表明H2能夠改善各種因素導致的器官功能障礙[3-6]，因此H2治療有著非常廣泛的應用前景；當H2濃度大于4.6%時有爆燃的風險[8]，為安全起見，筆者只采用了低濃度的H2吸入作為治療手段，這也是本研究的不足之處。

綜上所述，吸入H2能夠明顯減輕膿毒血癥引起的ALI，其機制可能與抑制炎性反應有關(guān)。

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（收稿日期：2015-04-25 本文編輯：張瑜杰）