陳金緒　馮照善　張慶金　謝正軼　林俊華

1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，廣西柳州545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣西柳州545006

熱預(yù)處理對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護作用

陳金緒1馮照善1張慶金2謝正軼2林俊華2

1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院組胚教研室，廣西柳州545006；2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣西柳州545006

目的觀察熱預(yù)處理（HA）對小鼠創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）的神經(jīng)保護作用。方法60只小鼠分為正常對照（NT）組、HA組、TBI組、HA+TBI組，每組15只，采用改良自由落體損傷裝置建立小鼠TBI模型。觀察和比較各組小鼠的麻醉蘇醒時間、蘇醒后的一般行為學(xué)表現(xiàn)、腦組織含水量，腦切片蘇木精-伊紅（HE）染色觀察病理學(xué)改變，F(xiàn)JB染色觀察神經(jīng)元變性情況。結(jié)果與TBI組比較，HA+TBI組的麻醉蘇醒時間縮短，腦組織含水量降低，腦組織染色顯示病理損傷程度減輕，變性神經(jīng)元減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HA+TBI組的麻醉蘇醒時間長于NT組與HA組，腦組織含水量高于NT組與HA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NT組與HA組的麻醉蘇醒時間和腦組織含水量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論閉合性腦損傷模型構(gòu)建成功，HA對閉合性腦外傷具有神經(jīng)保護作用。

熱預(yù)處理；創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)保護作用

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是慢性致殘和致死的主要原因之一，也是我國兒童和青年的主要致殘、致死原因。腦外傷后，局部組織發(fā)生繼發(fā)性的缺血缺氧性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的損傷，另外，機械性損傷可直接損傷腦細(xì)胞，使神經(jīng)元發(fā)生直接死亡或促進(jìn)程序性死亡，這兩種損傷方式都可導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種神經(jīng)后遺癥。因此，對神經(jīng)損傷的防治是搶救TBI的重要環(huán)節(jié)之一，應(yīng)對熱預(yù)處理（HA）的保護效應(yīng)進(jìn)行探討。有研究顯示，機體在HA后可產(chǎn)生保護效應(yīng)，通過交叉耐受機制，對多種應(yīng)激源具有保護作用［1-2］。HA的保護效應(yīng)是近年來國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點，且HA在實踐操作上更便捷，其應(yīng)用價值更大。本研究采用腦外傷模型，旨在探討HA對小鼠TBI的神經(jīng)保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

60只8～9周齡健康雄性C57小鼠（由廣西科技大學(xué)實驗動物中心提供，合格證編號：2005A033），體重21.3～23.5 g，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照（NT）組、HA組、TBI組、HA+TBI組，各15只。NT組正常飼養(yǎng)，自由食水，照明7:00～19:00。其余3組按下述條件處理。飼養(yǎng)及實驗過程中遵守實驗動物管理與保護準(zhǔn)則。

1.2方法

1.2.1HA方法將小鼠暴露于38℃的動物實驗艙內(nèi)，2 h/d，不給食水，然后置于飼養(yǎng)環(huán)境中，連續(xù)刺激10 d。1.2.2 TBI模型的建立采用改良的自由落體撞擊損傷裝置建立小鼠TBI模型，具體方法：給小鼠腹腔注射10%（400 mg/kg）水合氯醛，麻醉起效后固定于鼠板上，碘酒消毒頭皮，沿正中線從眼部至耳后切開并分離骨膜，暴露頭骨。在冠狀縫與人字縫連線中點向右3～5 mm處標(biāo)記撞擊點，使撞擊桿從3 cm高處自由下落，使小鼠發(fā)生閉合性腦損傷。為防止呼吸抑制，術(shù)后立即將小鼠置于氧氣箱中（20%O2+5%CO2）吸氧5 min，縫合頭皮，置于25℃環(huán)境中復(fù)蘇［3］。NT組和HA組不進(jìn)行撞擊，其余操作相同。

1.2.3Fluoro Jade B（FJB）染色過程FJB是一種熒光染料，與變性神經(jīng)元的親和力強，被認(rèn)為是特異性標(biāo)志變性神經(jīng)元的有效方法。染色過程：經(jīng)相應(yīng)組別處理后的小鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定，取腦組織進(jìn)行冰凍切片，晾干后進(jìn)行FJB染色及觀察，具體步驟如下：1%NaOH與80%乙醇混合液浸泡切片5 min→70%乙醇2 min→雙蒸水漂洗2 min→0.06%高錳酸鉀溶液15 min，在室溫置于搖床上緩慢震蕩→雙蒸水漂洗2 min→新鮮配制的0.0004%FJB（美國Chemicon公司）工作液中避光浸泡30 min→蒸餾水中漂洗3次，2 min/次→梯度脫水、透明、抗熒光淬滅劑封片→熒光顯微鏡下（激發(fā)光波長為450～490 nm）觀察并采集圖像。

1.2.4腦組織含水量測定按照實驗分組條件處理24 h后處死小鼠，快速取出全腦，剝離腦膜并稱重，隨后置于105℃烤箱中烘烤至恒重（兩次稱重質(zhì)量差≤0.2 mg），按照Elliott公式計算腦組織含水量：腦組織含水量=［（濕重-干重）/濕重］×100%。

1.2.5腦組織蘇木精-伊紅（HE）染色冰凍切片固定10～30 s→稍水洗1～2 s→蘇木精液染色（60℃）30～60 s→流水洗去蘇木精液5～10 s→1%鹽酸乙醇1～3 s→稍水洗1～2 s→促藍(lán)液顯藍(lán)5～10 s→流水沖洗15～30 s→0.5%曙紅液染色30～60 s→蒸餾水稍洗1～2 s→80%乙醇1～2 s→95%乙醇1～2 s→無水乙醇1～2 s→石炭酸二甲苯2～3 s→二甲苯（Ⅰ）2～3 s→二甲苯（Ⅱ）2～3 s→中性樹膠封固→顯微鏡下觀察并攝取圖像。

1.3觀察指標(biāo)

比較各組小鼠麻醉蘇醒時間（從注射麻醉劑開始至有自主活動的時間）、蘇醒后的一般行為學(xué)表現(xiàn)、腦組織含水量，腦切片HE染色觀察病理學(xué)改變，F(xiàn)JB染色觀察神經(jīng)元變性情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠麻醉蘇醒時間及蘇醒后一般行為學(xué)觀察

NT組小鼠的蘇醒時間為（27.5±4.7）min，HA組和HA+TBI組分別為（28.1±5.3）、（43.7±11.5）min，最后蘇醒的是TBI組小鼠，蘇醒時間為（62.9±13.7）min。NT組與HA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示HA不會延長小鼠的麻醉蘇醒時間；HA+TBI組的蘇醒時間均顯著長于NT組和HA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示TBI可顯著延長小鼠麻醉后的蘇醒時間；與TBI組比較，HA+TBI組的蘇醒時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示HA可加快小鼠麻醉后的蘇醒速度。蘇醒后，NT組和HA組小鼠很快恢復(fù)正常活動，主動進(jìn)食水，HA+TBI組小鼠行動欠穩(wěn)定，平衡感稍差，TBI組小鼠蘇醒后反應(yīng)遲鈍，活動明顯減少，平衡能力差，提示經(jīng)HA后的小鼠發(fā)生TBI時，腦損傷程度輕于未經(jīng)HA的小鼠。

2.2各組小鼠腦組織含水量比較

TBI組小鼠的腦組織含水量為（82.6±2.7）%，高于HA+TBI組［（77.8±2.1）%］、HA組［（72.3±1.5）%］和NT組［（72.5±1.8）%］，HA+TBI組高于HA組和NT組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HA組和NT組比較差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，TBI可導(dǎo)致小鼠腦組織含水量顯著升高，HA可顯著減輕TBI導(dǎo)致的腦水腫程度，而HA不會增加腦組織含水量。

2.3各組小鼠腦組織病理改變

各組小鼠腦組織切片HE染色結(jié)果見圖1（封四），NT組和HA組小鼠的腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，未觀察到細(xì)胞腫脹等明顯異?，F(xiàn)象；HA+TBI組和TBI組可觀察到大量的細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，核明顯固縮、破裂、溶解，染色質(zhì)邊集，部分細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡化，且TBI組的空泡化細(xì)胞多于HA+TBI組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常程度更強。

2.4各組小鼠腦組織神經(jīng)元變性情況

各組小鼠腦組織切片F(xiàn)JB染色結(jié)果見圖2（封四），發(fā)綠色熒光的為FJB陽性細(xì)胞。NT組和HA組有少量的FJB陽性細(xì)胞，HA+TBI組和TBI組陽性細(xì)胞明顯增多，其中TBI組陽性細(xì)胞最多。

3　討論

腦外傷后，局部組織發(fā)生繼發(fā)性的缺血缺氧性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的損傷；機械性損傷可直接損傷腦細(xì)胞，使神經(jīng)元發(fā)生直接死亡或促進(jìn)程序性死亡，這兩種損傷方式都可導(dǎo)致患者出現(xiàn)各種神經(jīng)后遺癥。因此，對神經(jīng)損傷的防治是搶救TBI的重要環(huán)節(jié)之一。國內(nèi)外諸多研究顯示，適當(dāng)?shù)娜毖毖躅A(yù)處理可以提高腦神經(jīng)細(xì)胞對后續(xù)損傷的抵抗力，熱預(yù)處理的保護效應(yīng)是近年來國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點，且熱預(yù)處理在實踐操作上更便捷，其應(yīng)用價值更大。

目前常用的腦外傷研究模型有液壓型、凍傷型及自由落體型。臨床上最常見的腦外傷往往是經(jīng)暴力所致，最長發(fā)生在高處墜落、交通事故等撞擊事件中形成的閉合性腦損傷，因此自由落體型腦外傷模型更能代表臨床上閉合性腦損傷的形成過程及病理特征［4-5］。本組研究在經(jīng)典的腦外傷動物模型構(gòu)建方法基礎(chǔ)上，改進(jìn)了自由落體裝置，選用小鼠作為實驗動物，經(jīng)自由落體敲擊損傷后，動物出現(xiàn)一般行為和神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)，出現(xiàn)明顯腦水腫現(xiàn)象，且在細(xì)胞學(xué)上出現(xiàn)了明顯的病理改變，神經(jīng)元發(fā)生變性，表明本組研究的閉合性腦外傷模型構(gòu)建是成功的，其研究結(jié)果可信。

有研究表明，HA有助于增強機體對缺血缺氧的耐受能力［6-9］。諸多實驗研究結(jié)果表明，HA后，遭受缺血及缺氧/再灌注等損傷時，動物的心肌細(xì)胞損傷程度顯著低于未經(jīng)HA的動物［10-12］。也有研究指出，HA可顯著減輕實驗動物發(fā)生TBI時的損傷程度，有助于臨床恢復(fù)［13-15］。但關(guān)于HA對腦損傷的保護機制，目前研究仍未闡述清楚。本研究顯示，實驗小鼠經(jīng)HA后，遭受閉合性腦損傷時，其神經(jīng)損傷程度明顯輕于未經(jīng)HA的小鼠，主要表現(xiàn)在麻醉蘇醒更快，蘇醒后一般行為狀態(tài)更好，腦外傷導(dǎo)致的腦水腫程度減輕，細(xì)胞染色顯示病理損傷和神經(jīng)元變性減輕，表明HA對閉合性腦外傷具有神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究能夠在一定程度上證實HA對后續(xù)腦外傷確實具有一定的保護效應(yīng)，為相關(guān)研究提供了參考依據(jù)。但關(guān)于其保護作用的機制，仍有待進(jìn)一步研究，故在后續(xù)研究中，可對這種保護效應(yīng)的作用途徑進(jìn)行探討，從而發(fā)現(xiàn)HA保護效應(yīng)的作用靶點或相關(guān)分子信號通路，為臨床救治開拓新的方向。

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Neuroprotective effects of heat preconditioning on mice with traumatic brain injury

CHEN Jinxu1FENG Zhaoshan1ZHANG Qingjin2XIE Zhengyi2LIN Junhua2
1.Department of Histology and Embryology，Medical College，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou545006，China；2.Department of Anatomy，Medical College，Guangxi University of Science and Technology，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou545006，China

Objective To investigate the neuroprotective effects of heat preconditioning（HA）on mice with traumatic brain injury（TBI）.Methods 60 mice were divided into normal control（NT）group，HA group，TBI group and HA+TBI group，each group of 15 mice.Free fall injury improved device was adopted to establish the mice model of TBI.The anesthesia recovery time，general behavior，brain tissue water content of mice in each group were compared and observed.Pathological change was observed by using HE staining，neuronal degeneration was observed by using FJB staining.Results Compared with TBI group，the anesthesia recovery time of HA+TBI group was shorter，brain tissue water content of HA+TBI group was lower，pathological damage of brain tissue in HA+TBI group was reduced，neuro degeneration of HA+TBI group was decreased，the difference was statistical significance（P＜0.05）.The anesthesia recovery time of HA+TBI group was longer than that of NT group and HA group respectively，brain tissue water content of HA+TBI group was higher than that of NT group and HA group respectively，the difference was statistical significance（P＜0.05）.The anesthesia recovery time and brain tissue water content of NT group and HA group were compared，with no statistical difference（P＞0.05）.Conclusion Closed TBI mice model has established successfully，and HA can offer neuroprotective effects on closed TBI.

Heat preconditioning；Traumatic brain injury；Neuroprotective effect

R651

A

1673-7210（2015）09（a）-0020-04

2015-04-21本文編輯：李亞聰）

陳金緒（1974.1-），男，碩士，主要從事組織胚胎學(xué)的教學(xué)與研究。