謝斌

紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，浙江 紹興 312030

采用Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)模型及大鼠在體腸灌流模型研究分析淫羊藿炮制的意義

謝斌

紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，浙江 紹興 312030

目的：采用Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)模型及大鼠在體腸灌流模型研究分析淫羊藿炮制的意義。方法：建立Caco-2模型及大鼠在體腸灌流模型，分別統(tǒng)計(jì)淫羊藿中含有的5種黃酮化合物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況及在腸道代謝中的吸收情況。結(jié)果：分別觀察淫羊藿炮制品中的5種黃酮化合物在Caco-2模型中的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)情況，其中寶藿苷Ⅰ吸收滲透參數(shù)＞淫羊藿苷＞朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C。建立大鼠在體腸灌流模型，分別觀察淫羊藿炮制品中的5種黃酮化合物在大鼠在體腸灌流模型中各腸段吸收運(yùn)轉(zhuǎn)情況。在十二指腸段和空腸段，淫羊藿苷參透參數(shù)明顯高于其他黃酮化合物；在回腸段和結(jié)腸段，寶藿苷滲透參數(shù)最高。結(jié)論：適當(dāng)?shù)呐谥瓶擅撊ヒ蜣近S酮的糖基，有助于淫羊藿的吸收。

淫羊藿；炮制；Caco-2細(xì)胞；大鼠在體腸灌流模型

淫羊藿是一種藥用植物，以羊脂油為最常見的炮制方法［1］。關(guān)于淫羊藿炮制機(jī)理研究，主要分為化學(xué)成分以及藥理作用兩方面，但是由于未能深入以及全面體現(xiàn)其藥物的炮制機(jī)理，導(dǎo)致炮制前后藥物的成分以及吸收等研究較少［2～3］。淫羊藿主要成分為黃體酮類，這類黃體酮結(jié)構(gòu)特殊，筆者進(jìn)行Caco-2細(xì)胞膜型分析以及研究淫羊藿中的黃體酮活性成分的腸內(nèi)吸收以及其功能代謝機(jī)理等研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物大鼠在體腸灌流模型采用健康成年大鼠，性別不限，身長為（1.53±0.32）cm，體重為（212.42±32.53）g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法建立Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)模型及大鼠在體腸灌流模型，其中Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)模型建立方法為：培養(yǎng)環(huán)境為5%二氧化碳、37℃，采取DMEM培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗液，于T57培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，4～5天后達(dá)到融合，再利用胰酶-EDTA液進(jìn)行消化，然后按照1∶3比例傳代或者接種到試驗(yàn)所需器皿中［4］。在體腸灌流模型建立方法為：麻醉試驗(yàn)大鼠后，將其腹腔打開，量取適當(dāng)長度腸段，在兩端插管，等滲生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，換灌流液，利用恒速泵灌流腸腔，同時(shí)收集灌流液，對不同時(shí)間的灌流液濃度進(jìn)行測定［5］。模型建立完成后，采用淫羊藿炮制品對模型進(jìn)行吸收試驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)淫羊藿中含有的5種黃酮化合物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)情況及在腸道代謝中的吸收情況，并比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1Caco-2模型淫羊藿各種化合物吸收滲透參數(shù)比較見表1。分別觀察淫羊藿炮制品中的5種黃酮化合物在Caco-2模型中的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)情況，其中寶藿苷Ⅰ吸收滲透參數(shù)＞淫羊藿苷＞朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C。

表1　Caco-2模型淫羊藿各種化合物吸收滲透參數(shù)比較 ×10-6cm/s

2.2大鼠在體腸灌流模型淫羊藿各種化合物吸收滲透參數(shù)比較見表2。建立大鼠在體腸灌流模型，分別觀察淫羊藿炮制品中的5種黃酮化合物在大鼠在體腸灌流模型中各腸段吸收運(yùn)轉(zhuǎn)情況。在十二指腸段和空腸段，淫羊藿苷參透參數(shù)明顯高于其他黃酮化合物；在回腸段和結(jié)腸段，寶藿苷滲透參數(shù)最高。

表2　大鼠在體腸灌流模型淫羊藿各種化合物吸收滲透參數(shù)比較（±s）　　×10-6cm/s

表2　大鼠在體腸灌流模型淫羊藿各種化合物吸收滲透參數(shù)比較（±s）　　×10-6cm/s

黃酮化合物寶藿苷Ⅰ淫羊藿苷朝藿定A朝藿定B朝藿定C十二指腸2.34±0.42 6.32±0.84 4.32±0.58 3.85±0.64 3.14±0.77空腸2.41±0.14 5.24±0.73 3.84±0.54 3.25±0.46 2.74±0.42回腸1.53±0.34 0.97±0.17 0.46±0.13 0.94±0.21 0.69±0.23結(jié)腸1.05±0.14 0.33±0.12 0.28±0.07 0.42±0.15 0.46±0.16

3　討論

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物，是我國常用的藥物之一，主要治療腎虛陽痿遺精早泄，腰膝痿軟，四肢厥冷，更年期高血壓等疾病，可有效緩解患者四肢厥冷，使肌肉逐漸恢復(fù)剛強(qiáng)有力狀態(tài)，能促進(jìn)性功能亢進(jìn)，提高機(jī)體免疫功能等［6］。尤其是淫羊藿藥物經(jīng)過炮制后可以更有效體現(xiàn)其藥物作用功能，但是現(xiàn)代科學(xué)研究與分析成果并不能有效體現(xiàn)出其藥物經(jīng)過炮制后，有效成分的變化情況。筆者以淫羊藿經(jīng)過炮制后，其腸吸收情況為切入點(diǎn)，采用Caco-2模型以及大鼠在體腸灌流模型進(jìn)行其藥物炮制機(jī)理研究［6～7］。

其中Caco-2細(xì)胞來源于結(jié)腸腺癌細(xì)胞，由于其功能及滲透特征等方面與小腸十分類似，所以Caco-2細(xì)胞經(jīng)常用于代替小腸表皮細(xì)胞作為其吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)藥物的體外模型。Caco-2作為小腸的替代品的主要特點(diǎn)是其結(jié)構(gòu)與生理作用均與小腸上皮細(xì)胞十分相似，機(jī)體中的小腸上皮細(xì)胞相關(guān)的酶系體在Caco-2細(xì)胞中同樣存在，其中的酶系與正常成熟小腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出逆向分化不同，Caco-2在培養(yǎng)下，可以生長在多孔的滲透聚酯，以達(dá)到自身機(jī)體相融合以及產(chǎn)生分化腸上皮細(xì)胞，形成不間斷的單層細(xì)胞組織。在上述試驗(yàn)中，筆者研究分析了淫羊藿炮制品中所含有的5種黃體酮化合物成分在Caco-2中的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)情況，通過結(jié)果可以看出，作為單糖苷的寶藿苷Ⅰ的滲透參數(shù)要高于二糖苷淫羊藿苷，而二糖苷淫羊藿苷的滲透參數(shù)又高于三糖苷朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C，從而表明，淫羊藿黃酮的吸收效果與其糖基數(shù)目呈反比關(guān)系，通過此實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在小腸部位，淫羊藿黃酮的糖基數(shù)越低，其越有利于小腸的吸收。

筆者同時(shí)建立了大鼠在體腸灌流模型，研究分析了十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸對淫羊藿中5種黃酮的在體吸收情況。在體腸灌流模型保證了腸道神經(jīng)功能以及內(nèi)分泌的完整沒用損傷，同時(shí)血液以及其他淋巴液的供應(yīng)完好，可提高模型的生物活性以及機(jī)體內(nèi)腸道代謝功能。特別通過實(shí)驗(yàn)可以看出，5種淫羊藿黃酮在十二指腸、空腸部位滲透系數(shù)均明顯高于回腸、結(jié)腸部位。此外，作為二糖苷和三糖苷的淫羊藿苷和朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C，在十二指腸和空腸部位代謝量較多，而在回腸、結(jié)腸部位代謝量相對于十二指腸和空腸部位明顯減少，從而證明，其主要吸收部位在十二指腸和空腸部位。而寶藿苷Ⅰ是一種單糖苷，其在腸道吸收過程中不需要水解，所以在十二指腸、空腸部位的吸收和在回腸、結(jié)腸部位之間的差別并沒有其他淫羊藿黃酮明顯［8］。

綜上所述淫羊藿黃酮的腸吸收代謝與其糖基數(shù)目有關(guān)，淫羊藿黃酮的糖基數(shù)目越低，其滲透系數(shù)越高，腸吸收情況越好。也就是說，人體的腸道吸收主要以單糖苷為主，其多糖苷必須經(jīng)過水解等形式后轉(zhuǎn)化為單糖苷才可以進(jìn)行吸收，而淫羊藿中的5中黃酮中有4種為多糖苷，提高其有效成分的利用，必須使淫羊藿中的多糖苷轉(zhuǎn)化為單糖。淫羊藿的炮制程序可能可以有效的使淫羊藿糖基脫去糖苷，從多糖苷轉(zhuǎn)化為次糖苷，促進(jìn)了淫羊藿黃酮的滲透性和水解性，更加有利于腸道吸收，從而提高淫羊藿的作用。本研究以腸道吸收代謝淫羊藿5種黃酮的情況為切入點(diǎn)，討論研究淫羊藿的炮制機(jī)理，揭示了淫羊藿炮制的科學(xué)內(nèi)涵，從而闡述了淫羊藿的炮制價(jià)值與意義。

［1］陳彥，賈曉斌，丁安偉.淫羊藿炮制機(jī)理研究回顧與新思路［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（9）：1439-1442.

［2］陳彥，賈曉斌，范晨怡，等.不同品種淫羊藿生品與炮制品中5種黃酮成分的含量比較［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，45（7）：516-519.

［3］陳彥，賈曉斌，譚曉斌，等.大鼠腸道水解酶對淫羊藿黃酮苷的處置影響［J］.中國藥學(xué)雜志，2010，45（7）：516-519.

［4］曾寶，王春玲，吳安國，等.Caco-2細(xì)胞模型的建立及其在中藥吸收研究中的應(yīng)用探討［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：570-573.

［5］譚曉斌，賈曉斌，陳彥，等.在體腸灌流模型及其在中藥研究中的應(yīng)用［J］.中成藥，2007，29（11）：1665-1668.

［6］江永南，莫紅纓.淫羊藿苷納米纖維膜自組裝囊泡的制備及表征［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（6）：509.

［7］崔莉，孫娥，樊宏偉，等.藥理效應(yīng)法測定淫羊藿生品及不同炮制品的藥動學(xué)參數(shù)［J］.中藥材，2013，36（3）：370.

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

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謝斌（1983-），男，主管中藥師，研究方向：中藥臨床藥學(xué)。