李園園，張 舫

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110015)

論 著

妊娠期尼古丁暴露對子鼠臟器發(fā)育的影響

李園園，張 舫

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110015)

目的 探討妊娠期尼古丁暴露對小鼠子代臟器發(fā)育的影響。方法 昆明孕小鼠24只，隨機分為對照組和1、2、4mg/kg尼古丁暴露組，各組小鼠自孕7 d至分娩，分別多點皮下注射1 mL生理鹽水或尼古丁生理鹽水溶液(尼古丁含量分別為1、2、4mg/kg)，1次/d。子鼠哺乳喂養(yǎng)，21 d斷乳。檢測子鼠出生3、7、14、21、35d時的體重及子鼠5周齡時的腦、肝、心、脾、腎臟器系數(shù)及組織形態(tài)。結(jié)果 各尼古丁暴露組子鼠初始出生時體重均低于對照組(P<0.05)，出生35d時，各組子鼠體重隨尼古丁暴露劑量增高而降低(P<0.05)；5周齡時，子鼠心肌纖維萎縮，心肌纖維間隙增大；肝細胞水腫；脾臟特征性結(jié)構(gòu)邊界不清，白髓面積變小，紅髓面積增大等；大腦海馬和腎組織未見明顯異常。尼古丁暴露劑量達到2 mg/kg時，子鼠心臟和脾臟的臟器系數(shù)均顯著上降(P<0.05)。結(jié)論 妊娠期尼古丁暴露導致子鼠多器官組織形態(tài)異常，這可能是尼古丁致生后遠期慢性疾病發(fā)生的解剖學基礎(chǔ)和發(fā)育源性病因。

妊娠期；尼古丁；子代；臟器發(fā)育；組織形態(tài)

尼古丁(nicotine)，又稱煙堿，是煙草中的主要毒性成分。流行病學調(diào)查顯示，中國有煙民3.5億人，被動吸煙人數(shù)高達7.7億人，其中有20%～50%的婦女在妊娠期吸煙，而50%不吸煙的孕婦也存在被動吸煙[1]。尼古丁極易通過胎盤屏障，并在胎兒體內(nèi)蓄積，從而影響胎兒的生長發(fā)育。而生命早期(胚胎期和生后早期)暴露于有害因素環(huán)境中可能影響發(fā)育編程，從而被機體“記憶”下來，對遠期發(fā)育和成年期健康造成負面影響[2]。調(diào)查研究顯示，母親吸煙和產(chǎn)前尼古丁暴露可導致子代持續(xù)性新陳代謝系統(tǒng)與多組織器官異常，與子代生后遠期多種慢性疾病發(fā)病可能存在因果關(guān)系[3-4]。然而，有關(guān)妊娠期尼古丁暴露對子代器官發(fā)育形態(tài)學影響的研究報道較少。本研究建立妊娠期尼古丁暴露小鼠模型，觀察子鼠生長發(fā)育情況，檢測子鼠(生后5周)重要臟器心、肝、脾、腦、腎的形態(tài)，為深入研究妊娠期尼古丁暴露對遠期健康和疾病的影響提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

尼古丁(純度99%)購于北京伊普瑞斯科技有限公司。動物體重秤(精確度0.1 g)、電子天平(北京賽多利斯)，倒置相差熒光顯微鏡(Olympus公司)，數(shù)碼顯微鏡照相系統(tǒng)、MiE3.1圖像處理軟件(山東易創(chuàng)電子有限公司)。

1.2 實驗動物和分組染毒

10周齡昆明小鼠，雌鼠24只，雄鼠12只，30～35g，由大連醫(yī)科大學動物中心提供[許可證號：SCXK(遼)2008-0002，20130715]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃、濕度50%～60%、自然節(jié)律采光，普通飲食，自由進食和飲水。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，雌鼠與雄鼠2∶1合籠，12 h后進行陰栓觀察或陰道涂片，觀察到陰栓或精子視為懷孕，并記錄為孕期第0天。

將孕鼠隨機分為4組，每組6只，分別為對照組和1、2、4mg/kg尼古丁暴露組。各組小鼠自孕7 d至分娩，分別皮下注射1 mL生理鹽水或尼古丁生理鹽水溶液(尼古丁含量分別為1、2、4mg/kg)，1次/d。各組孕鼠自然分娩，子鼠出生后21 d斷乳，自由進食水。

1.3 妊娠結(jié)局觀察

各組孕鼠分娩時，記錄各孕鼠產(chǎn)仔數(shù)、子鼠死胎數(shù)及畸形胎數(shù)。

1.4 子鼠體重檢測

子鼠出生3、7、14、21、35d分別稱量體重，測量3次取平均值為當天體重。

1.5 子鼠臟器系數(shù)檢測

子鼠5周齡時，每組隨機取子鼠6只，雌雄各半，脫頸處死，處死后立即分離腦、肝、心、脾、腎組織，生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱重，按公式[臟器系數(shù)=(臟器重量/體重)×100%]計算臟器系數(shù)。

1.6 子鼠臟器發(fā)育形態(tài)學檢測

子鼠5周齡時，每組隨機取子鼠6只，雌雄各半，全身灌流，留取腦、心、肝、脾、腎等器官，4%多聚甲醛液固定。蠟塊包埋，HE染色。顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 妊娠期尼古丁暴露對妊娠結(jié)局的影響

對照組孕鼠產(chǎn)子鼠56只，1、2、4mg/kg尼古丁暴露組孕鼠分別產(chǎn)子鼠51、61、56只，各孕鼠產(chǎn)仔數(shù)均在8～13只之間，各組孕鼠產(chǎn)仔數(shù)間差異無顯著性意義(P>0.05)。對照組和各劑量尼古丁暴露組孕鼠產(chǎn)子鼠均無死胎，無畸形。

2.2 妊娠期尼古丁暴露對子鼠體重的影響

如表1所示，與對照組相比，各組子鼠7日齡前體重低于對照組，差異有顯著性意義(P<0.05)。隨著子鼠的成長發(fā)育，1 mg/kg尼古丁孕鼠暴露對子鼠體重的影響逐漸降低，出現(xiàn)“生長追趕”現(xiàn)象，子鼠出生7 d后，1 mg/kg尼古丁暴露組與對照組子鼠體重差異無顯著性意義(P>0.05)；2 mg/kg和4mg/kg尼古丁暴露組子鼠在出生35d內(nèi)，各時段體重均低于對照組，差異有顯著性意義(P<0.05)。而且出生21 d后，隨著尼古丁暴露劑量的增加，各組子鼠體重逐漸下降。

表1 妊娠期尼古丁暴露對子鼠體重的影響

2.3 妊娠期尼古丁暴露對子鼠臟器系數(shù)的影響

如表2所示，與對照組相比，妊娠期尼古丁暴露對子鼠肝臟、腦和腎臟臟器系數(shù)的影響均無顯著性意義(P>0.05)；尼古丁暴露劑量達到2 mg/kg時，子鼠心臟和脾臟的臟器系數(shù)均顯著下降，差異有顯著性意義(P<0.05)，而且隨著尼古丁暴露劑量的增加，子鼠心臟和脾臟的臟器系數(shù)逐漸下降。

表2 妊娠期尼古丁暴露對子鼠臟器系數(shù)的影響

2.4 妊娠期尼古丁暴露對子鼠臟器形態(tài)的影響

顯微鏡下可見，尼古丁暴露組子鼠心肌纖維橫截面積較對照組縮小，心肌纖維出現(xiàn)萎縮，心肌纖維間隙增大，異常程度隨尼古丁劑量增加而逐漸加重。見圖1。

對照組子鼠脾臟白髓近圓形，分散，呈灰白點狀，均勻致密藍染，邊緣區(qū)界線清楚，紅髓位于白髓與邊緣區(qū)之外，面積小，著色淺，呈條索狀，內(nèi)含大量紅細胞(圖2A和a)。尼古丁暴露組子鼠白髓面積減少，形態(tài)不規(guī)則，染色不均勻，邊緣區(qū)界線不清，紅髓面積增大，部分區(qū)域連接呈大片狀，異常程度隨尼古丁劑量增加逐漸加重(圖2 B～D和b～d)。

圖1 妊娠期尼古丁暴露對子鼠心臟組織形態(tài)影響

圖2 妊娠期尼古丁暴露對子鼠脾臟組織形態(tài)影響

對照組子鼠肝板結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞排列致密，胞質(zhì)均勻(圖3A和a)；尼古丁暴露組子鼠肝板結(jié)構(gòu)不清，肝細胞出現(xiàn)輕度水腫，胞間見散在亮白區(qū)域，異常程度隨尼古丁劑量增加逐漸加重(圖3B～D和b～d)。

對照組子鼠大腦海馬各區(qū)神經(jīng)元排列整齊，細胞分層清晰，CA1區(qū)椎體細胞明顯分化；尼古丁暴露組子鼠大腦海馬結(jié)構(gòu)與對照組無明顯區(qū)別，未見病理改變。見圖4。

對照組子鼠腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰、完整，近曲小管、遠曲小管以及腎小球形態(tài)正常(圖5A和a)；各尼古丁暴露組子鼠腎臟未見水腫、萎縮、炎細胞浸潤等，與對照組比較無明顯改變(圖5B～D和b～d)。

圖3 妊娠期尼古丁暴露對子鼠肝臟組織形態(tài)影響

圖4 妊娠期尼古丁暴露對子鼠大腦海馬形態(tài)的影響

圖5 妊娠期尼古丁暴露對子鼠腎臟組織形態(tài)影響

3 討 論

生命早期(胚胎期和生后早期)是哺乳動物發(fā)育的關(guān)鍵時期，細胞處在快速生長和分化階段，此期間的個體比生命中的任何時期都更易受到有害因素的影響，從而干擾多器官組織結(jié)構(gòu)形成、功能建立，對遠期健康造成負面影響[5]。流行病學和動物實驗均證實，生命早期尼古丁暴露具有發(fā)育毒性，但有關(guān)生命早期尼古丁暴露對器官形成影響的研究鮮見報道。本研究對妊娠期小鼠進行不同劑量的尼古丁暴露，結(jié)果顯示，實驗組子鼠全部存活，沒有死胎、畸形胎發(fā)生，提示實驗劑量尼古丁尚不能影響小鼠妊娠結(jié)局。而小鼠出生后哺乳期生長體重的變化是一個較敏感的反映生長發(fā)育的指標[6]，本研究結(jié)果顯示，妊娠期小鼠尼古丁暴露使子鼠出生體重明顯減低，且在同一生長發(fā)育階段，隨著染毒劑量的增加，實驗組子鼠體重逐漸降低，提示妊娠期尼古丁暴露對子代體格發(fā)育具有負面影響。

研究表明，妊娠期尼古丁暴露可明顯增加后代高血壓病和冠心病的發(fā)生等[7]；流行病學研究提示，妊娠期尼古丁暴露可顯著增加“嬰兒猝死綜合癥”的發(fā)病風險，而“嬰兒猝死綜合癥”和異常的心臟傳導系統(tǒng)以及惡性心律失常有密切關(guān)系[8]。上述文獻提示，宮內(nèi)尼古丁暴露可能與心血管疾病發(fā)生之間存在因果關(guān)系。本研究中，尼古丁暴露組斷乳子鼠心臟組織形態(tài)受損，心肌纖維萎縮，心肌顯微間隙增大，且上述改變隨尼古丁暴露濃度升高而程度加重，提示生命早期尼古丁暴露可能影響子代心臟正常組織結(jié)構(gòu)形成，對生后遠期心血管功能可能造成負面影響。

哺乳動物脾臟具有造血和免疫兩大功能，主要由其內(nèi)的紅髓和白髓組織結(jié)構(gòu)完成。流行病學調(diào)查和動物實驗有關(guān)尼古丁暴露對脾臟結(jié)構(gòu)影響的研究報道鮮見，但尼古丁暴露人群免疫功能受損已得到證實。早在1977年，研究人員就提出吸煙對人體健康的多數(shù)有害作用都體現(xiàn)在對免疫系統(tǒng)的危害上。研究顯示，在人和動物都發(fā)現(xiàn)吸煙與NK細胞的百分比及活性降低有關(guān)[9]；猴子的脾細胞和人的白細胞經(jīng)香煙煙霧處理后對有絲分裂原的反應(yīng)能力降低[10]；尼古丁單獨也可以引起細胞免疫和體液免疫的改變，如可以降低炎癥、降低脾細胞中抗體形成細胞的反應(yīng)、降低T細胞受體介導的信號傳導、低外周血單個核細胞的增殖等[11]。本研究中，尼古丁暴露組子鼠脾臟出現(xiàn)特征性結(jié)構(gòu)邊界不清，白髓面積逐漸變小，紅髓面積逐漸增大等表現(xiàn)，提示生命早期尼古丁暴露可能影響子代脾臟正常組織結(jié)構(gòu)形成，對生后遠期免疫和造血功能可能造成負面影響。

前瞻性研究顯示，吸煙與肝癌之間存在病因?qū)W聯(lián)系，是肝癌發(fā)生的危險因素之一，吸煙人群肝癌發(fā)病率明顯升高[12]。Wang等[13]報道，大鼠妊娠期尼古丁暴露所產(chǎn)子鼠肝臟發(fā)育遲緩，肝臟特征性酶表達水平降低，肝臟內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。最近，Ma等[14]報道，妊娠期大鼠尼古丁皮下注射使得子代180日齡子鼠肝功能異常，血及肝內(nèi)甘油三酯明顯增高。本研究中，尼古丁暴露組子鼠肝臟出現(xiàn)水腫，并隨尼古丁暴露濃度升高而程度加重，這種病理損傷對肝臟遠期功能可能造成不良影響。

近期有動物模型證實，青少年時期的動物暴露于尼古丁會產(chǎn)生行為和電生理學的變化，并且會持續(xù)至成年[15]。文獻報道，尼古丁不僅能抑制小雞睫狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和PC12細胞突起的生長[16]， 還能抑制雞胚膽堿能神經(jīng)元樹突的生長[17]，提示尼古丁對腦發(fā)育中正常的細胞分裂后事件，如神經(jīng)細胞突起生長及細胞遷移、識別等過程等，有干擾作用。流行病學資料表明，孕婦接觸尼古丁會導致后代智力下降和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，如認知障礙、注意力渙散、學習和記憶能力低下、行為異常等，上述文獻提示，妊娠期尼古丁暴露可能與子代神經(jīng)精神疾病發(fā)生之間存在因果關(guān)系。但在本研究中，各尼古丁暴露組子鼠海馬結(jié)構(gòu)均未發(fā)現(xiàn)明顯改變，這可能與觀察靶點和檢測水平有關(guān)。 孕期尼古丁暴露導致的子代生后遠期認知功能異常，可能與大腦皮層發(fā)育異常有關(guān)；張海心等[19]報道，妊娠期尼古丁暴露使21日齡子鼠大腦組織神經(jīng)細胞凋亡。在下一步工作中，本課題組將對各尼古丁暴露組子代小鼠的大腦皮層及海馬組織的進行電鏡觀察及分子水平的檢測，以明確妊娠期尼古丁暴露對子代小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。

孕期不良環(huán)境對子代的跨代遺傳效應(yīng)已經(jīng)被證實，但是其潛在的機制仍是近年來研究的熱點。本研究結(jié)果提示，妊娠期尼古丁暴露可能影響子代心、肝、 脾組織形態(tài)形成，為深入研究尼古丁的發(fā)育毒性以及尼古丁對遠期健康的影響積累了資料，提供了依據(jù)。然而，本研究只觀察了子代重要臟器的形態(tài)，沒有對相應(yīng)臟器的功能和遠期疾病發(fā)生進行追蹤，其因果關(guān)系的確定尚需要進一步研究。

[1] 郭自景, 徐丹, 羅瀚文, 等. 孕期尼古丁暴露所致子2代小鼠神經(jīng)內(nèi)分泌代謝編程改變的可遺傳效應(yīng)[J]. 中國藥理學與毒理學雜志， 2015, 2(2): 277-283.

[2] Imura H. Life course health care and preemptive approach to non-communicable diseases[J]. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 2013, 89(10): 462-473.

[3] Somm E, Schwitzgebel VM, Vauthay DM, et al. Prenatal nicotine exposure and the programming of metabolic and cardiovascular disorders[J]. Mol Cell Endocrinol, 2009, 304(1-2): 69-77.

[4] Bublitz MH, Stroud LR. Maternal smoking during pregnancy and offspring brain structure and function: review and agenda for future research[J]. Nicotine Tob Res, 2012, 14(4): 388-397.

[5] Fudvoye J, Bourguignon JP, Parent AS. Endocrine-disrupting chemicals and human growth and maturation: a focus on early critical windows of exposure[J]. Vitam Horm, 2014, 94(4): 18-25.

[6] Chen Z, Kamei C. Facilitating effects of histamine on spatial memory deficit induced by scopolamine in rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2000, 21(9): 814-818.

[7] Yuan M, Cross SJ, Loughlin SE, et al. Nicotine and the adolescent brain[J]. J Physiol, 2015, 593(16): 3397-3412.

[8] Neary MT, Breckenridge RA. Hypoxia at the heart of sudden infant death syndrome?[J]. Pediatr Res, 2013, 74(4): 375-379.

[9] Almanzar G, Eberle G, Lassacher A, et al. Maternal cigarette smoking and its effect on neonatal lymphocyte subpopulations and replication[J]. BMC Pediatr, 2013, 13(1): 57-62.

[10] Jubri Z, Latif AA, Top AG, et al. Perturbation of cellular immune functions in cigarette smokers and protection by palm oil vitamin E supplementation[J]. Nutr J, 2013, 12(1): 2-10.

[11] Liu Z, Han B, Li P, et al. Activation of α7nAChR by nicotine reduced the Th17 response in CD4(+)T lymphocytes[J]. Immunol Invest, 2014, 43(7): 667-674.

[12] 楊萬水, 高靜, 高姍, 等. 吸煙與肝癌前瞻性研究的薈萃分析[J]. 腫瘤, 2010, 30(3): 247-249.

[13] Wang T, Chen M, Yan YE, et al. Growth retardation of fetal rats exposed to nicotine in utero: possible involvement of CYP1A1, CYP2E1, and P-glycoprotein[J]. Environ Toxicol, 2009, 24(1): 33-42.

[14] Ma N, Nicholson CJ, Wong M, et al. Fetal and neonatal exposure to nicotine leads to augmented hepatic and circulating triglycerides in adult male offspring due to increased expression of fatty acid synthase[J]. Environ Toxicol, 2014, 275(1): 1-11.

[15] Lydon DM, Wilson SJ, Child A, et al. Adolescent brain maturation and smoking: what we know and where we′ re headed[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2014, 45(5): 323-342.

[16] Kang L, Tian MK, Bailey CD, et al. Dendritic spine density of prefrontal layer 6 pyramidal neurons in relation to apical dendrite sculpting by nicotinic acetylcholine receptors[J]. Front Cell Neurosci, 2015, 9(1): 398-405.

[17] Britto LRG, Lindst rom JM, Torrao AS. Nicotine and A-bungarotoxin midigy the dendritic growth of cholinocept ive neurons in the developing chick tectum[J]. Dev Brain Res, 2003, 143(1): 115-118.

[18] Sepehri G, Parsania S, Hajzadeh MA, et al. The effects of co-administration of opium and morphine with nicotine during pregnancy on spatial learning and memory of adult male offspring rats[J]. Iran J Basic Med Sci, 2014, 17(9): 694-701.

[19] 張海心, 薛曉東, 翟秀巖. 宮內(nèi)暴露尼古丁對生后小鼠大腦皮層神經(jīng)細胞凋亡的影響[J]. 解剖科學進展, 2005, 11(4): 295-297.

Effect of nicotine exposure during maternal pregnancy on organ development of offspring mice

LI Yuan-yuan, ZHANG Fang

(DepartmentofObstetricsandGynecology,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,Shenyang110015,China)

Objective To investigate the effects of nicotine exposure during pregnancy on organ development of offspring mice. Methods Twenty-four pregnant Kunming mice were randomly and evenly divided into four groups. Mother mice were subcutaneously injected with nicotine saline at 0, 1, 2, 4mg/kg daily from gestation day 7 to childbirth. Body weight of offspring was monitored from birth to postnatal 35days. Offspring brain, heart, liver, spleen, and kidney were observed under microscope. Results Compared with the control, the weights of offspring in nicotine exposure groups were all decreased (P<0.05). At the postnatal day 35, the weights decreased with the increasing of nicotine concentration. The atrophy in myocardial fibers, hydropic degeneration in liver cells, and obscure characteristic structure of spleen with atrophic white pulp and expanded red pulp were found under microscope. Conclusion Nicotine exposure during pregnancy could result in abnormal morphology in multiple organs of offspring mice, which might be the anatomical basis and pathogeny of chronic diseases in later life.

pregnancy; nicotine; offspring; organ development; organ structure

10.11724/jdmu.2015.06.06

李園園(1968-)，女，遼寧沈陽人，副主任醫(yī)師。

張 舫，主治醫(yī)師。E-mail：1120430265@qq.com

R135.1

A

1671-7295(2015)06-0541-06

李園園，張舫. 妊娠期尼古丁暴露對子鼠臟器發(fā)育的影響[J].大連醫(yī)科大學學報，2015,37(6)：541-546.

2015-08-17；

2015-11-13)