趙彥濤　胡先同　韓麗偉　白玉龍　衷鴻賓

聚維酮碘作為脫鈣骨基質(zhì)保存劑的實(shí)驗(yàn)研究

趙彥濤胡先同韓麗偉白玉龍衷鴻賓

目的 探討聚維酮碘 （PVP-I）作為脫鈣骨基質(zhì) （demineralized bone matrix，DBM）長(zhǎng)期保存劑的可行性。方法 選用 4 種標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行 PVP-I 重復(fù) 5 次的滅菌效果驗(yàn)證。分別采用 CCK-8 法、PNPP 法、RT-PCR 法檢測(cè) PVP-I 對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、前交叉韌帶 （anterior cruciate ligament，ACL）活力以及成骨分化標(biāo)志分子 COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá)的影響；裸小鼠肌間隙植入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 PVP-I 長(zhǎng)期保存的 DBM成骨活性是否受到影響。結(jié)果 PVP-I 對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草桿菌黑色變種芽孢的殺滅率均為100%，對(duì)大腸桿菌的殺滅率為 88.7%；與對(duì)照組 （1±0.09）相比，高濃度 PVP-I 抑制細(xì)胞生長(zhǎng) （0.63±0.03）（P＜0.05），低濃度 PVP-I 不促進(jìn)也不抑制細(xì)胞增殖；PVP-I 顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的 ALP 活力，上調(diào) COL1α、ALP、RUNX2 mRNA 的表達(dá)量 （1.25±0.15、1.38±0.14、1.23±0.09）（P＜0.05），對(duì) OCN mRNA 的表達(dá)影響不明顯；裸鼠肌間隙植入實(shí)驗(yàn)表明，PVP-I 長(zhǎng)期保存的 DBM 其成骨活性不受影響。結(jié)論 PVP-I 有望被開(kāi)發(fā)成DBM 的保存劑。

聚維酮碘；移植，同種；滅菌；小鼠，裸

同種異體骨移植已成為治療骨缺損的重要手段，脫鈣骨基質(zhì) （demineralized bone matrix，DBM）的滅菌和保存在其中起到非常關(guān)鍵的作用?，F(xiàn)階段常用的滅菌方法包括：過(guò)氧乙酸聯(lián)合酒精浸泡、環(huán)氧乙烷熏蒸、60Co 輻照滅菌等［1］。但這些滅菌方法都會(huì)不同程度的損傷 DBM 中的活性成分，影響其成骨活性［2-4］。所以，開(kāi)發(fā)出理想的 DBM 滅菌及保存方法顯得尤為迫切。

長(zhǎng)期以來(lái)，聚維酮碘 （PVP-I）一直作為皮膚及傷口的消毒劑而被應(yīng)用于臨床各科室［5-6］。Zhao等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，PVP-I 處理能夠促進(jìn) DBM 的異位成骨能力，但其具體機(jī)制尚不清楚。用 PVP-I 長(zhǎng)期保存 DBM 后，其成骨活性是否受到影響也不明確。為此，筆者就 PVP-I 處理的 DBM 促進(jìn)異位成骨的機(jī)制以及 PVP-I 長(zhǎng)期保存的 DBM 成骨活性是否受到影響進(jìn)行了研究。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌 （ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌 （ATCC 6538）、枯草桿菌黑色變種芽孢 （ATCC 9732）、白色念珠菌 （ATCC 10231）由美國(guó) ATCC 公司提供，PVP-I （安捷高科 20140302）、DBM （中國(guó)人民解放軍全軍骨科研究所提供）、CCK-8 試劑（同仁化學(xué)所，日本 GH802）、PNPP （大連美侖生物A0122A）、Mgcl2 （北京化工廠 10012892）、二乙醇胺 （大連美侖生物 N0514AS）、RT 試劑盒 （寶生生物AK2401）、PCR 試劑盒 （寶生生物 AK3604）、PCR引物 （上海生工合成）方法。

二、滅菌效果驗(yàn)證

1. 菌種的選擇：根據(jù)國(guó)標(biāo) GB15981-1995 要求，選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌黑色變種芽孢、白色念珠菌四種標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行 PVP-I滅菌效果驗(yàn)證。

2. 滅菌：稱(chēng)量無(wú)菌 DBM 共 8 份，每份 1 g，分為對(duì)照組和 PVP-I 組，每組 4 份。調(diào)整上述菌株菌懸液的濃度為 107 cfu / ml，向每個(gè)樣品 DBM 中加入該菌懸液 2 ml，4 ℃ 環(huán)境下放置 12 h。用無(wú)菌生理鹽水沖洗 DBM 表面，然后對(duì)照組每個(gè)樣品加入 2 ml 無(wú)菌 PBS；PVP-I 組每個(gè)樣品加入 2 ml 0.5% PVP-I，4 ℃ 放置 24 h。取出 DBM 后用無(wú)菌 PBS 沖洗 1 次，然后每個(gè)樣品加入 10 ml DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng) 12 h，收集上清液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

3. 平板菌落計(jì)數(shù)：配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 250 ml，高壓蒸汽滅菌。取 8 個(gè)無(wú)菌試管，每個(gè)試管中加入20 ml 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。待試管中的培養(yǎng)基冷卻至45 ℃ 時(shí)，將 1.2 中收集到的上清液稀釋 1000 倍，取 100 μl 加入試管中?；靹蚝蟮谷霟o(wú)菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基冷卻凝固后將培養(yǎng)皿放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱，24 h后取出計(jì)數(shù)。

4. 滅菌試驗(yàn)重復(fù) 5 次。

三、MC3T3 細(xì)胞增殖、ALP 活性以及成骨相關(guān)蛋白基因的表達(dá)

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：MC3T3-E1 細(xì)胞用含 10% FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到 80% 融合時(shí)，進(jìn)行傳代。用 PBS 清洗細(xì)胞 1 次，然后加入0.25% 胰酶進(jìn)行消化，離心后用含 10% FBS 的 α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為 2×104/ ml，接種到培養(yǎng)板中。96 孔板每孔接種 100 μl，12 孔板每孔接種 2 ml。

2. 細(xì)胞增殖檢測(cè)：MC3T3-E1 細(xì)胞接種到 96 孔板，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h。對(duì)照組加入全培，PVP-I 組加入有效碘含量為 320 ng / ml、160 ng / ml、80 ng / ml、40 ng / ml、20 ng / ml 的 PVP-I。37 ℃ 培養(yǎng)后 48 h 加入 10% CCK-8 溶液，其后 2 h，在 450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

3. ALP 活力檢測(cè)：MC3T3-E1 細(xì)胞接種到 96 孔板，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h。對(duì)照組加入全培，PVP-I 組加入有效碘含量為 80 ng / ml 的 PVP-I。37 ℃ 培養(yǎng)1 周加入 PNPP 試劑。其后 2 h 加入 0.1 M 的 NaOH終止反應(yīng)，405 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。

4. COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá)檢測(cè) MC3T3-E1 細(xì)胞接種到 12 孔板，對(duì)照組加入全培，PVP-I 組加入有效碘含量為 80 ng / ml的 PVP-I。37 ℃ 培養(yǎng) 72 h，提取細(xì)胞總 RNA。RT-PCR 反應(yīng)檢測(cè) COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 表達(dá)。

四、經(jīng) PVP-I 保存后的 DBM 異位成骨實(shí)驗(yàn)

1. 材料滅菌：稱(chēng)量 24 份 DBM，每份 0.1 g。分為對(duì)照組、PVP-I 24 h 組、PVP-I 12 周組，每組 8 份（n=8）。對(duì)照組用60Co 輻照滅菌，輻照劑量 25 KGy。PVP-I 24 h 組用 PVP-I 在 4 ℃ 條件下浸泡 24 h，PVP-I 12 周組用 PVP-I 在 4 ℃ 條件下浸泡 12 周。使用前用無(wú)菌 PBS 沖洗 DBM 表面 3～5 次。

2. 裸鼠肌間隙植入實(shí)驗(yàn)：裸鼠 24 只，分為對(duì)照組、PVP-I 24 h 組、PVP-I 12 周組，每組 8 只。0.3% 的戊巴比妥鈉麻醉，俯臥位。局部碘伏消毒。用手術(shù)刀在大腿皮膚沿長(zhǎng)軸做一 5 mm 切口，眼科鑷沿肌間隙將肌肉分開(kāi)。將材料植入裸鼠肌間隙，縫合肌肉和皮膚。術(shù)后 4 周取材，將 DBM 及周?chē)募∪馊∠?，進(jìn)行石蠟切片，HE 染色。觀察異位成骨情況。

結(jié)　果

一、PVP-I 的滅菌效果

與對(duì)照組相比，PVP-I 對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草桿菌黑色變種芽孢的殺滅率均為100%，對(duì)大腸桿菌的殺滅率為 88.7% （表1）。

表1 0.5% PVP-I 對(duì)幾種標(biāo)準(zhǔn)菌種的殺滅效果Tab.1 The sterilization effects of 0.5% PVP-I to standard strains

二、不同濃度 PVP-I 對(duì) MC3T3 細(xì)胞增殖的影響

圖1 顯示：PVP-I 濃度為 320 ng / ml 和 160 ng / ml時(shí)，對(duì) MC3T3 細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用；當(dāng)濃度降至 80 ng / ml 時(shí)，PVP-I 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用消失，出現(xiàn)了非常微弱的促增殖作用，但與對(duì)照組相比，其作用不明顯。繼續(xù)降低 PVP-I 濃度，并未出現(xiàn)明顯促增殖的作用。

圖1 PVP-I 對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The proliferation of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

三、PVP-I 對(duì) MC3T3 細(xì)胞前交叉韌帶 （anterior cruciate ligament，ACL）活力的影響

與對(duì)照組 （1±0.05）相比，PVP-I 組 （1.25± 0.04）細(xì)胞的 ALP 活力明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）（圖2）。

圖2 PVP-I 對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞 ALP 活力的影響Fig.2 The ALP activity of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

四、PVP-I 對(duì) MC3T3 細(xì)胞 ALP、COL1α、RUNX2 mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PVP-I 組細(xì)胞的 ALP （1.25± 0.15）、COL1α （1.38±0.14）及 RUNX2 （1.23±0.09）的 mRNA 表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。兩組的 OCN mRNA 表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 PVP-I 對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞幾種成骨標(biāo)志分子 mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 The mRNA expressions of osteogenic molecule of MC3T3-E1 by the stimulation of PVP-I

五、PVP-I 保存時(shí)間對(duì)異位成骨能力的影響

圖4 顯示：經(jīng) PVP-I 保存 12 周與保存 24 h 的DBM 均有很強(qiáng)的異位成骨能力分別為：（2.2±0.03）、（2.3±0.05）。與對(duì)照組 （1±0.03）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。

圖4 PVP-I 浸泡對(duì) DBM 異位成骨能力的影響 a：對(duì)照組；b：PVP-I 浸泡 24 h；c：PVP-I 浸泡 12 周Fig.4 The effects of PVP-I to DBM on its ectopic osteogenesis　a： Control group； b： 24 hours in PVP-1； c： 12 weeks in in PVP-I

討　論

PVP-I 是碘與表面活性劑絡(luò)合而成的一種廣譜抗菌消毒劑。其滲透性強(qiáng)，刺激性小，殺菌作用時(shí)間長(zhǎng)，被廣泛應(yīng)用于臨床各個(gè)科室。骨科常用 PVP-I溶液進(jìn)行關(guān)節(jié)或傷口的沖洗［8-9］，往往能取得良好的殺菌效果。已有學(xué)者將 PVP-I 應(yīng)用到組織材料的消毒方面：汪喜順［10］用 PVP-I 對(duì)兔半月板進(jìn)行金黃色葡萄球菌染菌后的滅菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果滅菌率達(dá)到100%。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，選取了 4 種標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行滅菌驗(yàn)證，其中包括 1 種革蘭氏陽(yáng)性菌 （金黃色葡萄球菌），1 種革蘭氏陰性菌 （大腸桿菌），1 種真菌 （白色念珠菌）和 1 種細(xì)菌芽孢 （枯草桿菌黑色變種芽孢）。結(jié)果顯示，PVP-I 對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和枯草桿菌黑色變種芽孢的殺菌率均達(dá)到 100%。對(duì)大腸桿菌的殺菌率為 88.7%，未能全部殺滅，原因可能有：（1）染菌實(shí)驗(yàn)中，菌懸液用有機(jī)培養(yǎng)基 DMEM 配制，染菌后 DBM 雖經(jīng) PBS 沖洗，但 DBM 表面或內(nèi)部孔隙還是會(huì)不可避免地殘留部分培養(yǎng)基，而 PVP-I 在有機(jī)物質(zhì)存在的情況下，殺菌效果會(huì)減弱［11］；（2）滅菌時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)中滅菌時(shí)間為24 h，延長(zhǎng)滅菌時(shí)間可能會(huì)取得更好的滅菌效果［12］。雖然 PVP-I 對(duì)大腸桿菌的滅菌沒(méi)有達(dá)到 100%，但這是在刻意染菌之后的情況。實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中，如果嚴(yán)格控制初始污染菌，DBM 上污染的大腸桿菌數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，再結(jié)合前期 DBM 處理時(shí)酒精的應(yīng)用，應(yīng)該會(huì)取得良好的殺菌效果。

筆者既往的研究發(fā)現(xiàn)，PVP-I 處理的 DBM，其異位成骨的能力有所增加，但其機(jī)制尚不明確［7］。本實(shí)驗(yàn)從 PVP-I 對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響入手，對(duì) PVP-I 增強(qiáng) DBM 異位成骨能力的機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，PVP-I 并不促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而高濃度的 PVP-I 反而抑制成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與 Jiang等［13］對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)研究結(jié)果是一致的。

ALP 活力是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化的一個(gè)重要指標(biāo)［14］。本研究采用 PNPP 法，檢測(cè)了 PVP-I 對(duì)成骨細(xì)胞 ALP 活力的影響，結(jié)果表明，PVP-I 能夠明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞的 ALP 活力。進(jìn)一步觀察 PVP-I 對(duì)成骨細(xì)胞 COL1α、ALP、RUNX2、OCN mRNA 的影響，發(fā)現(xiàn) PVP-I 明顯上調(diào) COL1α、ALP 及 RUNX2 mRNA 的表達(dá)，這與 Jiang 等［13］的報(bào)道一致。但 PVP-I 對(duì) OCN mRNA 的影響不明顯，這可能是由于干預(yù)時(shí)間太短。OCN 屬于成骨細(xì)胞晚期分化的標(biāo)志，在礦化形成的時(shí)候才開(kāi)始大量表達(dá)［15］。有研究表明，PVP-I 干預(yù)成骨細(xì)胞后 4 周，與對(duì)照組相比，OCN 的基因表達(dá)有顯著差異［13］。

本研究的前期研究中的異位成骨實(shí)驗(yàn)是用PVP-I 處理 DBM 24 h 的結(jié)果。要將 PVP-I 作為 DBM的保存劑，需要將 DBM 長(zhǎng)期浸泡在 PVP-I 中。這是否會(huì)影響其成骨活性，本研究結(jié)果表明，DBM在 PVP-I 中浸泡 3 個(gè)月，不會(huì)影響其成骨活性。筆者還會(huì)對(duì) PVP-I 處理更長(zhǎng)時(shí)間的 DBM 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)，為 PVP-I 作為 DBM 保存劑的可行性提供更可靠的依據(jù)。

綜上所述，PVP-I 具有很強(qiáng)的殺菌能力，而且其處理過(guò)的 DBM 的成骨活性不降反升，長(zhǎng)達(dá) 3 個(gè)月的保存也不會(huì)影響 DBM 活性。這些都為 PVP-I 作為組織材料的保存劑提供了理論依據(jù)。通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)研究，PVP-I 有望被開(kāi)發(fā)成一種理想的組織材料保存劑。

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（本文編輯：李貴存）

A study of PVP-I as a long term preservation agent for demineralized bone matrix

ZHAO Yan-tao， HU Xian-tong，HAN Li-wei， BAI Yu-ling， ZHONG Hong-bin. Department of Orthopedics， the frst Affliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing， 100048， PRC

ObjectiveTo discuss the feasibility of PVP-I being the preservation of demineralized bone matrix （DBM）. MethodsFour standard strains were used to perform the sterilization experiment in repeated 4 times. PVP-I was added to MC3T3-E1， then cell proliferation and viability were determined by CCK-8 and differentiation status by PNPP and RT-PCR. Muscle implant experiment of nude mice was performed to verify whether the activity of DBM was damaged since it was immersed in PVP-I for a long time. ResultsThe sterilization rates of PVP-I to staphylococcus aureus， monilia albican and bacillus subtilis were all of 100%， while to Escherichia coli 88.7%. CCK-8 assay showed reduced proliferation of the MC3T3-E1 cells when the PVP-I was at a high concentration（0.63±0.03）（P＜0.05）. When the concentration of PVP-I was down-regulated， a negligible effect was observed on MC3T3-E1 growth. PVP-I signifcantly enhanced the activity of ALP and up-regulated the expressions of COL1α， ALP and RUNX2 （1.25±0.15， 1.38±0.14， 1.23±0.09）（P＜0.05）. However， PVP-I did not affect the expression of OCN. The nude mice experiment suggested that the activity of DBM was not infuenced by PVP-I. ConclusionsPVP-I may be applied as the preservation of DBM.

Povidone-iodine；Transplantation， homologous；Sterilization；Mice， nude

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.005

R944.1， R318

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81201380）；軍事醫(yī)學(xué)項(xiàng)目 （13CXZ028），（AWS14C007）；北京市自然科學(xué)基金

100048北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨科研究所 （趙彥濤、衷鴻賓）；100048北京，北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心 （趙彥濤、衷鴻賓、胡先同、韓麗偉、白玉龍）；100048北京，北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司科研部 （胡先同、韓麗偉、白玉龍）

2015-08-04）

（7152144）；北京市科技新星項(xiàng)目 （XXJH2015102）；304 醫(yī)院臨床部重點(diǎn)扶持項(xiàng)目 （2014ZD001）