孫立國　范宏斌　李宏國　屈玲　倉寶成　薛英森　劉鑫成　李丹

三相蠶絲組織工程韌帶構(gòu)建及其生物相容性的研究

孫立國范宏斌李宏國屈玲倉寶成薛英森劉鑫成李丹

目的 評價三相蠶絲組織工程韌帶的理化性質(zhì)及生物相容性。方法 編織蠶絲網(wǎng)狀支架，提取絲素蛋白，利用硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸鈉、羥基磷灰石 （HA）及絲素蛋白修飾三相支架，測定支架材料形貌及表面元素。支架材料接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）后利用掃描電鏡 （SEM）、激光共聚焦顯微鏡，觀察細(xì)胞的黏附及增殖情況。結(jié)果 蠶絲去除絲膠后，表面變光滑，脫絲膠前蠶絲纖維的直徑為 （9.89±1.98）μm，脫絲膠后大小為 （9.14±1.75）μm，表面經(jīng)脫絲膠處理后蠶絲纖維直徑?jīng)]有顯著改變 （P=0.221）。表面元素分析表明 B 區(qū)中的 S 和 Na 元素及 C 區(qū)中的 Ca 元素比 A 區(qū)有顯著提高，并且材料的孔徑在 60～80 μm。A、B、C 區(qū)的細(xì)胞在培養(yǎng)后 4 h 與培養(yǎng)后 2 h 相比，細(xì)胞黏附率分別為：A 區(qū)（83.2±3.4）%，B 區(qū) （81.8±2.8）%，C 區(qū) （71.1±5.4）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.0001），表明細(xì)胞培養(yǎng)后4 h 大部分細(xì)胞在材料上有較好的黏附。掃描電鏡觀察，接種后 1 天，BMSCs 在材料上黏附良好，接種后 7 天細(xì)胞爬滿材料表面并可見細(xì)胞偽足深入材料內(nèi)部生長?；?/ 死細(xì)胞染色利用激光共聚焦顯微鏡觀察培養(yǎng)的 7 天比 1 天的細(xì)胞增殖明顯，且未見明顯死亡，細(xì)胞在材料的多個層次可見。結(jié)論 構(gòu)建的三相蠶絲組織工程韌帶具有良好的生物相容性，利于 BMSCs 的黏附增殖。

組織工程；材料試驗；生物相容性材料；蠶絲

前交叉韌帶 （anterior cruciate ligament，ACL）位于膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)，對維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性和靈活性有重要作用。ACL 損傷是臨床常見疾病，僅美國每年就有 35 萬臺 ACL 移植手術(shù)，治療花費(fèi)約 60 億美元［1］。ACL 損傷常導(dǎo)致膝部活動異常、疼痛及骨性關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響患者日常生活。

因 ACL 損傷后再生困難，手術(shù)重建往往是最終的選擇。傳統(tǒng)的重建策略包括利用自體組織、同種異體組織及人工韌帶進(jìn)行移植重建。自體組織移植常導(dǎo)致取材部位疼痛、功能異常、異體或異種組織移植存在潛在的疾病傳染風(fēng)險；人工合成材料來源廣泛，但存在對宿主的異物刺激反應(yīng)，遠(yuǎn)期穩(wěn)定性及力學(xué)性能的丟失等問題。目前應(yīng)用于臨床的人工韌帶結(jié)構(gòu)單一，韌帶在骨隧道中的愈合主要是膠原纖維與骨組織的直接結(jié)合，在結(jié)合部位由于“軟-硬”組織的直接連接缺乏力學(xué)梯度，容易造成應(yīng)力集中，從而導(dǎo)致重建失敗。

蠶絲具有良好的力學(xué)性能、可降解性和生物相容性，是理想的韌帶支架材料。本研究利用編織機(jī)將蠶絲編織成網(wǎng)狀支架，將其分隔為三個區(qū)域：韌帶區(qū) （A 區(qū)）、軟骨區(qū) （B 區(qū)）、骨區(qū) （C 區(qū)）。利用絲素造孔修飾 A 區(qū)；利用硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸鈉-絲素蛋白復(fù)合物修飾 B 區(qū)；利用羥基磷灰石 （HA）修飾 C 區(qū)。修飾后的支架材料經(jīng)過卷折后形成韌帶移植物，從而進(jìn)一步用來重建韌帶-骨結(jié)合部。本研究旨在對構(gòu)建的三相蠶絲韌帶仿生支架的微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性進(jìn)行研究，為下一步體內(nèi)研究打下基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實驗材料與設(shè)備

家蠶生絲購于蘇州蠶絲加工廠，硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸鈉、Alamar blue、活/死細(xì)胞染色試劑盒購于美國 Sigma 公司；碳酸鈉、苦味酸胭脂紅、甲醇、氯化鈣、磷酸氫二鈉、乙醇、丙酮、磷酸鹽緩沖液購于西安科昊生物有限公司；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、0.05% 胰蛋白酶 / 0.02% EDTA 購于美國 Gibco公司；溴化鋰購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；透析袋購于美國 Thermo 公司；所需消毒的實驗材料均在60Co 照射下消毒滅菌。實驗動物即新生胎兔 （3 天）購自西安迪樂普生物資源開發(fā)有限公司。

二、實驗方法

1. 蠶絲脫絲膠：蠶絲生絲 20 g 置于 5 L 濃度0.02 M / L 的碳酸鈉溶液加熱煮沸 30 min，蒸餾水清洗 3 遍后放置于干燥箱內(nèi)烘干，得到脫絲膠蠶絲。將已脫絲膠的蠶絲及生絲經(jīng)離子濺射儀噴金處理后，利用 SEM 觀察脫絲膠情況。

2. 絲素蛋白制備：按照 1 g 脫絲膠蠶絲加入 4 ml濃度 9.3 M / L 的溴化鋰溶液的比例，在 60 ℃ 的條件下攪拌、溶解蠶絲。待完全溶解后移入透析袋中利用蒸餾水透析后 7 天，4 ℃，9000 rpm，離心 30 min，取上清，利用干燥法測量得到的絲素蛋白溶液濃度并利用蒸餾水配制濃度為 2% 的絲素蛋白溶液。

3. 三相蠶絲韌帶支架的制備：在編織機(jī)上用平針編織法編織蠶絲后，固定于 40 mm×70 mm 的支架上，按上述方法脫絲膠處理烘干后，安裝在自制三相蠶絲韌帶支架分隔器上 （圖1），材料被分隔成A1，A2，B 和 C 區(qū)。在 A1，A2 及 C 區(qū)加入 2% 絲素蛋白溶液 1 ml，1.3 ml 和 3.4 ml；將 0.1 g 硫酸軟骨素和 5 mg 透明質(zhì)酸鈉加入 2% 絲素蛋白溶液 10 ml中，攪拌溶解后，取 2 ml 加入 B 區(qū)。待液體分布均勻，將分隔器放入 -20 ℃ 冰箱預(yù)冷凍 2 h，放入-80 ℃ 冰箱冷凍 2 h，最后冷凍干燥。凍干后將分隔器放置于 90% 甲醇溶液，30 min，使絲素蛋白異構(gòu)為不溶于水的 β 折疊結(jié)構(gòu)，倒掉溶液后置于室溫干燥。在甲醇處理過的分隔器 C 區(qū)加入 0.2 M / L 氯化鈣溶液 2 ml，37 ℃ 放置 1 h 倒掉，濾紙吸干殘留溶液，再加入 0.12 M / L 磷酸氫二鈉溶液 2 ml，37 ℃放置 1 h 倒掉溶液，濾紙吸干殘留溶液，最后放入50 ℃ 干燥箱內(nèi)干燥后形成 HA 涂層，至此，成功制備了三相蠶絲韌帶支架。

圖1 三相蠶絲支架的構(gòu)建Fig.1 Construction of the three-phase silk scaffold

4. 三相支架的表征：將三相支架的各區(qū)用導(dǎo)電膠固定在樣品臺上，采用掃描電鏡和能譜色散 X 射線光譜分析技術(shù)對各區(qū)的形貌和成分進(jìn)行觀察和分析 （圖2）。

圖2 掃描電鏡下的形貌和表面元素分析Fig.2 Morphology and surface element analysis of SEM

5. 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）的原代細(xì)胞培養(yǎng)：胎兔BMSCs 在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后 1 天換液，后每隔 2～3 天換 1 次液，細(xì)胞達(dá)到 80% 融合時，按 1∶2 或 1∶3 的比例傳代，細(xì)胞傳至第三代備用。

6. 支架材料細(xì)胞的黏附觀察、表面形貌、活 /死細(xì)胞染色及細(xì)胞增殖檢測：將制備的支架材料的A 區(qū)、B 區(qū)、C 區(qū)修剪成面積 2 cm2的圓盤狀支架材料，利用60Co 消毒后放置于 24 孔板，接種濃度為 2.5×105/ ml 的 BMSCs 細(xì)胞懸液 1.4 ml，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在接種 0，2，4，8 h，用 0.05% 胰蛋白酶 / 0.02% EDTA 將支架上的細(xì)胞消化下來并利用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，繪制細(xì)胞黏附百分率-時間柱狀圖（圖3）。

圖3 細(xì)胞黏附率Fig.3 Cell adhesion rate

7. SEM 支架材料細(xì)胞黏附觀察：在接種 BMSCs 1、7 天棄去 24 孔板中的培養(yǎng)液并用 PBS 清洗2 次，用濃度為 2.5% 的戊二醛固定，乙醇脫水，干燥后使用 SEM 觀察細(xì)胞在 A 區(qū)、B 區(qū)及 C 區(qū)上的生長情況。

8. 激光共聚焦下的活 / 死細(xì)胞染色：24 孔板內(nèi)的材料接種 BMSCs，接種后 1、7 天棄去培養(yǎng)液并用PBS 清洗 2 次。按照活 / 死細(xì)胞染色試劑盒說明書進(jìn)行染色后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察各區(qū)熒光染色情況?；罴?xì)胞在材料上被染色后發(fā)綠色熒光，死細(xì)胞被染色后發(fā)紅色熒光。

9. Alamar blue 細(xì)胞增殖測定：在 24 孔板上放入支架材料的孔內(nèi)接種 2.5×105/ ml 的 BMSCs 細(xì)胞懸液 1.4 ml，做 3 個復(fù)孔。在 1，3，5，7，9，11 天用Alamar blue 測定單細(xì)胞及各區(qū)支架上的細(xì)胞增殖情況。計算還原率，繪制還原率曲線 （圖4）。

圖4 激光共聚焦觀察 BMSCs 在支架材料上的生長情況 （活 / 死細(xì)胞染色 ×10）a～b：為 A 區(qū)細(xì)胞培養(yǎng) 1、7 天；c～d：為 B 區(qū)細(xì)胞培養(yǎng) 1、7 天；e～f：為 C 區(qū)細(xì)胞培養(yǎng) 1、7 天Fig.4 Growth of BMSCs on the scaffold material by laser confocal microscopy （Life / Dead Staining ×10）　a-b： 1 d and 7 d in area A；c-d： 1 d and 7 d in area B； e-f： 1 d and 7 d in area C

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 22.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以±s 表示，兩組比較利用 t 檢驗，多組間比較利用 ANOVA，計算 P 值，設(shè)定 P＜0.05 為統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)　果

一、三相蠶絲支架的制備

圖1a 為自制的三相韌帶分隔器，c 為編織的支架安裝的分隔器上，b 為分區(qū)示意圖，d 為修飾后的三相蠶絲支架。

二、SEM 觀察蠶絲脫絲膠前后表面形態(tài)

利用 SEM 放大 500 倍，觀察已脫絲膠和粗脫絲膠的蠶絲纖維表面情況 （圖5）。a 為粗脫絲膠的生絲，可見蠶絲纖維表面有片狀物包裹，表面粗糙，粘有微小顆粒。b 為脫絲膠后的蠶絲纖維，可見表面光潔，順滑，無損傷。脫絲膠前蠶絲顯微大小為 （9.89±1.98）μm，脫絲膠后大小為 （9.14± 1.75）μm，經(jīng) t 檢驗分析可知，表面經(jīng)脫絲膠處理后蠶絲纖維直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.221）。

圖5 掃描電鏡觀察蠶絲表面形貌 （×500）Fig.5 Silk surface morphology by SEM （×500）

三、三相蠶絲韌帶的表征

能譜分析以 X 射線能量為橫坐標(biāo) （EnergykeV），X 射線計數(shù) （KCnt）為縱坐標(biāo)表明：B 區(qū)中的 S 和 Na 元素及 C 區(qū)中的 Ca 元素比 A 區(qū)有顯著提高，表明 B 區(qū)中成功引入硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸鈉成分，而 C 區(qū)表面則有羥基磷灰石的生成。已修飾的支架材料經(jīng) SEM 測量不同分區(qū)的孔徑為A 區(qū) （65.0±32.8）μm，B 區(qū) （60.3±34.9）μm，C 區(qū)（81.6±35.3）μm （表1）。

表1 不同分區(qū)的孔徑大小 （n = 100，x-±s）Tab.1 Pore size in different areas （n=100，±s）

表1 不同分區(qū)的孔徑大小 （n = 100，x-±s）Tab.1 Pore size in different areas （n=100，±s）

分區(qū)孔徑 （μm）A 區(qū)65.0±32.8 B 區(qū)60.3±34.9 C 區(qū)81.6±35.3

四、細(xì)胞黏附情況 （圖3，表2）

A、B、C 區(qū)的細(xì)胞在培養(yǎng)后 4 h 細(xì)胞黏附率［ 分別為：（83.2±3.4）%、（81.8±2.8）%、（71.1± 5.4）% ］，與 2 h 時 ［ （31.3±7.1）%、（24.6±4.9）%、（22.1±6.1）% ］ 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P= 0.0001），表明細(xì)胞培養(yǎng)后 4 h 大部分細(xì)胞均在材料上有較好的黏附。培養(yǎng)至少 8 h 達(dá)到 80%，說明材料對細(xì)胞的刺激較低，細(xì)胞在材料上有較好的黏附。

表2 不同分區(qū)在培養(yǎng)不同時間后的細(xì)胞黏附率 （±s）Tab.2 Cell adhesion rates in different areas and after different time points （±s）

表2 不同分區(qū)在培養(yǎng)不同時間后的細(xì)胞黏附率 （±s）Tab.2 Cell adhesion rates in different areas and after different time points （±s）

分區(qū)0 h2 h4 h8 h A 區(qū)11.8±6.331.3±7.183.2±3.488.0±7.5 B 區(qū)　9.6±5.824.6±4.981.8±2.887.7±2.9 C 區(qū)12.3±5.622.1±6.171.1±5.485.2±5.3

五、SEM 觀察材料上的 BMSCs

SEM 觀察支架材料各分區(qū)上 BMSCs （紅色箭頭所示）的生長情況 （圖6）。接種后 1 天，BMSCs 在材料上黏附良好，接種后 7 天，細(xì)胞爬滿材料表面并可見細(xì)胞偽足深入材料內(nèi)部生長。前期的實驗表明隨著材料表面復(fù)合的 HA 厚度的增加細(xì)胞在表面越難生長，細(xì)胞在蠶絲表面復(fù)合一層的 HA 比復(fù)合多層的更容易黏附、增殖［2］。圖6c，f 上觀察到材料表面的修飾的 HA，而細(xì)胞在材料上有較好的黏附。

圖6 SEM 觀察 BMSCs 在支架材料上的生長情況 （×1000）Fig.6 Growth of BMSCs on the scaffold material by SEM （×1000）

六、激光共聚焦觀察活 / 死細(xì)胞染色

材料上的細(xì)胞經(jīng)過活 / 死細(xì)胞染色，活細(xì)胞被染色后發(fā)綠色熒光，死細(xì)胞被染色后發(fā)紅色熒光，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡 Z 軸掃描并 3 D 構(gòu)建后觀察，結(jié)果如圖4 所示。由于材料存在自發(fā)熒光，綠色為

標(biāo)記的活細(xì)胞，紅色的為材料，而標(biāo)記的死細(xì)胞較少，培養(yǎng) 7 天的細(xì)胞增殖明顯且未見死亡，細(xì)胞在材料的多個層次可見，表明細(xì)胞在材料內(nèi)部增殖明顯。七、Alamar blue 測定細(xì)胞增殖曲線BMSCs 接種到支架材料上不同分區(qū)，在 1，3，5，7，9，11 天分別測定Alamar blue 并計算還原率繪制細(xì)胞增殖曲線 （圖7）。各區(qū)細(xì)胞在 2～5 天呈對數(shù)增長，接種后 5 天達(dá)到生長平臺期。由于材料提供充足的孔隙，其細(xì)胞能夠持續(xù)增殖。

圖7 細(xì)胞增殖Fig.7 Cell proliferation

討　論

目前，許多不同的生物材料都可以應(yīng)用于組織工程韌帶的重建上，但理想的組織工程韌帶支架需要具有良好的生物相容性，力學(xué)性能及能夠模擬正常韌帶結(jié)構(gòu)的特征。蠶絲是一種天然的生物材料，不僅具有出色的力學(xué)拉伸性能和良好的生物相容性，還具有緩慢的降解性，材料的降解為組織的長入提供充足的空間，這對新生組織至關(guān)重要。

相比于天然及合成材料，蠶絲表現(xiàn)出顯著的強(qiáng)度及韌性，在各種在不同的組織工程領(lǐng)域的研究，特別是在肌肉骨骼方面，表現(xiàn)尤為突出［3-5］。而且蠶絲材料可與許多材料復(fù)合應(yīng)用，沒有限制。由于蠶絲表面會有一層致密的絲膠，會引起免疫反應(yīng)，一般制備的蠶絲支架都會進(jìn)行脫絲膠處理［6］。常用的去除絲膠的方法有水煮沸法，高溫高壓法，堿性溶液法，皂堿法以及堿性蛋白酶脫絲膠等方法。堿性溶液脫絲膠法最常用，如碳酸鈉溶液煮生絲［5］。碳酸鈉溶液法脫絲膠不僅能夠較好地去除蠶絲表面的絲膠，而且絲素蛋白不會發(fā)生分解，但高濃度長時間的煮沸會造成絲素的重鏈發(fā)生降解而影響其生物力學(xué)性質(zhì)［7］。本實驗構(gòu)建的蠶絲韌帶支架經(jīng)過常規(guī)的脫絲膠方法，利用 SEM 觀察材料發(fā)現(xiàn)蠶絲顯微表面變?yōu)楣饣睦w維狀，表面上面原有的絲膠已被脫去，這有效避免了絲膠引起的不良反應(yīng)，而且蠶絲的纖維直徑?jīng)]有明顯的變小，能夠保存其生物力學(xué)性能。

支架材料的框架是由脫去絲膠的蠶絲構(gòu)成，提供主要的力學(xué)支持。不同修飾區(qū)域的內(nèi)部主要由絲素蛋白凍干后形成的疏松海綿狀結(jié)構(gòu)，不僅起支撐細(xì)胞為組織長入提供空間的作用，還有利于內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的流通。一般來說，孔徑在 150 μm 的支架材料適合應(yīng)用于骨組織工程，而對于軟組織的組織工程來說孔徑則需要 150～250 μm，這樣的孔徑既能保證細(xì)胞的長入，新生的 ECM 也能防止細(xì)胞漏出支架［8］。本實驗利用絲素蛋白及相應(yīng)的凍干條件，構(gòu)造了 60～80 μm 大小的孔徑，而這樣的孔徑可以為大小為 20 μm 左右的 BMSCs 提供充足的長入空間。而且，隨著絲素蛋白的緩慢降解，同時也為分泌出的 ECM 釋放出空間?？傊?，本研究的目標(biāo)是材料的降解與組織的生成達(dá)到動態(tài)平衡，從而使新生組織在結(jié)構(gòu)與功能上逐步代替支架材料。研究表明，蠶絲表面的 HA 涂層能誘導(dǎo) BMSCs 向成骨細(xì)胞方向分化［9］；HA 具有良好的骨傳導(dǎo)作用，并且隨著 HA 的降解成磷酸鹽等成分，可以減緩局部的無菌性炎癥的發(fā)生。因此，本實驗在蠶絲韌帶支架材料的骨區(qū)引入 HA 的修飾。軟骨區(qū)引入硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸成分，為軟骨的再生提高良好的物化環(huán)境。

種子細(xì)胞是韌帶組織工程化的關(guān)鍵因素，材料對于種子細(xì)胞的生物相容性是重建成功與否的關(guān)鍵問題。理想的組織工程種子細(xì)胞需要良好的增殖能力，并能持續(xù)分泌特定的 ECM，來維持并修復(fù)功能的損失。目前應(yīng)用于組織工程韌帶的種子細(xì)胞主要有兩類：一種是成體細(xì)胞，如韌帶細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，另一種是干細(xì)胞，如 BMSCs。韌帶細(xì)胞存在獲取來源有限，體外擴(kuò)增幾代后細(xì)胞活力下降明顯的問題。BMSCs 是組織工程常用的成體干細(xì)胞，具有獲取容易，增殖能力強(qiáng)及多向分化功能。研究表明 BMSCs 能夠向骨、軟骨及成纖維細(xì)胞分化。韌帶-骨結(jié)合部具有復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu) （韌帶、纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨、骨）。這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)會在骨和韌帶這兩種力學(xué)性質(zhì)不同的界面間起到過渡作用。BMSCs 的多分化性，能夠滿足這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的重建。韌帶-骨結(jié)合部種植不同細(xì)胞或構(gòu)建多相支架對于重建結(jié)合部具有重要的指導(dǎo)意義［10-11］。

本研究證實，在三相蠶絲支架上的各區(qū) BMSCs均能具有較好的黏附和增殖，說明制備的支架具有良好的細(xì)胞相容性，為下一步的體內(nèi)實驗打下基礎(chǔ)。研究構(gòu)建的三相韌帶組織工程支架為重建韌帶-骨結(jié)合部提供了新的思路。

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（本文編輯：李貴存）

Construction of three-phase silk tissue-engineered ligament and preliminary analysis of its biocompatibility

SUN Li-guo， FAN Hong-bin， LI Hong-guo， QU Ling， CANG Bao-cheng， XUE Ying-sen， LIU Xin-cheng， LI Dan. Institute of Orthopedics， Xijing Hospital， the Fourth Military Medical University， Xi'an， Shaanxi， 710032， PRC

FAN Hong-bin， Email： fanhb@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo evaluate physicochemical properties and biocompatibility of the three-phase silk tissue-engineered ligament. MethodsThe silk mesh was woven， and silk fbroin was extracted. The three-phase scaffold was modified with chondroitin sulfate， hyaluronic acid sodium， hydroxyapatite （HA）and silk fibroin. The surface morphology and element of the scaffold were determined. After bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）seeding， the cell's proliferation and adhesion were observed by scanning electron microscope （SEM）and laser confocal microscopy. ResultsAfter the removal of sericin， silk surface became smooth. The silk fber diameter was（9.89±1.98）μm. After the removal of sericin， the diameter was （9.14±1.75）μm. No signifcant differences existed in the diameter of silk fber （P=0.221）. A surface element analysis showed the Ca element in area C， S and Na elements in area B were all higher than those in area A. The pore size of the material was 60-80 μm. The cell adhesion rates of area A， B and C 4hrs later were （83.2±3.4）%， （81.8±2.8）% and （71.1±5.4）%， which were signifcantly different from those 2hrs later （P=0.0001）. It indicated that most of the cells were adherent to the material after 4hrs' cells culture. One day after the seeding， the BMSCs in the material adhered well by SEM. Seven days later， the cells covered the material surface and the pseudopodia grown into internal were visible. Using life / dead cell staining， the cells cultured 7d were of higher proliferation than 1d by laser confocal microscopy. The cells were visible in multiple levels of the material. ConclusionsThe constructed three-phase silk tissue-engineered ligament has good biocompatibility， which is conducive to the proliferation of BMSCs. It lays the foundation for the vivo experiment in the next.

Tissue engineering；Materials testing；Biocompatible materials；Silk

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.004

R318

國家自然科學(xué)基金 （31170936，31470316）

孫立國現(xiàn)工作單位：300081天津，北京軍區(qū)天津療養(yǎng)院 （孫立國）；710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所 （孫立國、范宏斌、李宏國、薛英森、劉鑫成、李丹），檢驗科 （屈玲）；450042鄭州，解放軍一五三中心醫(yī)院檢驗科 （倉寶成）

范宏斌，Email： fanhb@fmmu.edu.cn

2015-06-11）