周旭珍，饒桂維，李成平，活　潑（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江　杭州　310015）

超臨界CO2流體色譜分離2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚

周旭珍，饒桂維，李成平，活潑*
（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015）

采用超臨界CO2流體色譜分離酚類同分異構(gòu)體化合物：2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚。通過單因素法考察了色譜柱類型、改性劑種類、改性劑濃度、色譜柱溫、背壓對容量因子和分離度的影響，確定了較佳的分離條件：色譜柱Sepax SFC-Pyridine（250 mm× 4.6 mm，I.D.5 μm）；流動相:V（CO2）:V（乙醇）=90：10；流速：3 mL/min；柱溫：35℃；背壓：100 bar；紫外檢測波長：270 nm；進樣量：30 μL濃度為1.0 mg/mL的2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚的甲醇溶液，此時，分離時間在5 min以內(nèi)，分離度達(dá)到4.68。

超臨界CO2流體色譜；2，4-二叔丁基酚；2，6-二叔丁基酚

超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）是新近發(fā)展起來的一種色譜分離方法［1-2］。通常以超臨界CO2流體作為流動相，以固體吸附劑（如硅膠）或鍵和到載體上的高聚物為固定相。與常規(guī)的HPLC、GC技術(shù)相比，具有低粘度、高擴散和高傳質(zhì)速率等特點，超臨界流體介于氣體和液體之間的性質(zhì)，即可用于分析GC不適用的高沸點及熱不穩(wěn)定樣品，也可以測定液相中非極性化合物，如脂肪酸類，倍半萜類等。此外，SFC主要采用二氧化碳作為流動相，具有化學(xué)穩(wěn)定、不易燃、低毒和低污染的特點，且二氧化碳價格比有機溶劑低，因此SFC為一種低碳環(huán)保的分離分析技術(shù)［3-5］。2，4-二叔丁基酚、2，6-二叔丁基酚均為酚類化學(xué)物質(zhì)，這兩種酚在制藥、化纖和橡膠行業(yè)上廣泛地被作為中間媒介，在制備抗氧化劑、抗紫外劑上有廣泛的應(yīng)用。含酚類的廢水是目前環(huán)保工作中的重點和難點，該類廢水通常污染水源，毒死魚蝦，危害農(nóng)作物，并進而危害人類的健康［6-9］。當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者對此類化合物的分析測定主要采氣相色譜法，液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用等［10-12］。本課題組之前就采用高效液相色譜法對工業(yè)廢水中的這兩個酚類化合物進行了測定，但實驗耗費大量有機溶劑，且兩化合物出峰時間較長，完成分離需12 min，且兩峰的分離度約為1.5，在復(fù)雜基質(zhì)中較易被干擾［13］。本文嘗試用超臨界CO2流體色譜法對2，4-二叔丁基酚，2，6-二叔丁基酚2個同分異構(gòu)體進行分離，通過考察改性劑種類及濃度、色譜柱溫、背壓對分離的影響，確定了較佳的超臨界流體色譜條件。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

儀器：Investigator SFC System超臨界流體色譜系統(tǒng)（WATERS），含超臨界CO2流體泵和一個改性劑泵，柱溫箱、2998PDA檢測器；Sepax SFC-Pyridine柱（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm）；KQ-50B超聲波清洗機，AB204-N電子天平。

試劑：2，4-二叔丁基酚（97%，aladdin公司）；2，6二叔丁基酚（98%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇（美國天地公司）；CO240 L鋼瓶裝（純度99.99%，杭州新世紀(jì)混合氣體有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件

流動相為二氧化碳-甲醇、二氧化碳-乙醇、二氧化碳-乙腈及二氧化碳-異丙醇；檢測波長：270 nm；進樣量：30 μL；流速：3 mL/min；色譜柱溫、背壓、流動相組成見下述說明。

1.2.2對照品貯備溶液的制備

精密稱取2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚對照品各100 mg，分別置于25mL容量瓶中，加入適量的甲醇溶解并稀釋至刻度，充分搖勻；得到2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的貯備溶液，質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

1.2.3對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的的配置

從已配置好的對照品貯備溶液各取25 mL于100 mL容量瓶中，加入適量的甲醇稀釋至刻度線，充分搖勻，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.2.4容量因子k’及分離度Rs的計算

為了確定出較好的分離條件，不同改性劑、柱溫、背壓條件對2，4二叔丁基酚、2，6二叔丁基酚分離的容量因子k’和分離度Rs的影響［14-16］。為了區(qū)分2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的容量因子，分別用k1’、k2’表示。k’和Rs的計算如下：

式中：tR為樣品分子的保留時間。to為色譜柱的死時間。

式中：tR1、tR2分別為化合物的保留時間，W1、W2為所對應(yīng)的色譜峰底寬。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜柱的選擇

本文在流速為3 mL/min、背壓為100 bar、柱溫為35℃和改性劑為10%甲醇溶液時，采用Sepax SFC-Pyridine柱、Hypersil ODS2和ViridisTMSilica等色譜柱對該對化合物進行了分離。實驗結(jié)果表明：在同等條件下，2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚在Hypersil ODS2和ViridisTM Silica色譜柱上未能完全分開，分離效果差，而在Sepax SFC-Pyridine柱上的分離效果較佳。因此選擇Sepax SFC-Pyridine柱做進一步的優(yōu)化研究。

2.2改性劑的影響

在SFC分離中，因采用CO2作為流動相，而CO2為非極性，對于分離弱極性及極性化合物調(diào)節(jié)余地不大，因此，常加入改性劑來調(diào)節(jié)流動相的極性。常見的改性劑有甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇。改性劑的主要作用是改變流動相的極性，對超臨界流體色譜的分離有重要影響。本實驗在采用甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇作為改性劑，每種改性劑調(diào)節(jié)范圍設(shè)定為10%～25%，在流速為3 mL/ min、背壓為100 bar、柱溫為35℃的相同條件下進行分離時，乙腈作為改性劑分離效果最差，在體積比例分?jǐn)?shù)為10%和25%時兩峰未能分離，異丙醇分離效果比不上甲醇和乙醇，甲醇與乙醇的分離效果相當(dāng)，但我們可以看到，乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～25%變化時，兩種物質(zhì)的分離度幾乎都在5以上，在10%和15%時達(dá)到了10以上。綜合考慮選擇性α和容量因子k，本研究選用10%乙醇作為改性劑。

表1　改性劑種類及濃度對2，4二叔丁基酚、2，6二叔丁基酚的容量因子、選擇性和分離度的影響

2.3柱溫的影響

柱溫對分離的影響較為復(fù)雜，它綜合了兩方面的作用。一方面，隨著柱溫的升高，超臨界流體的密度降低，樣品分子的保留增強，容量因子增強；另一方面，隨著柱溫升高，樣品分子傳質(zhì)速率增加，有助于固定相表面脫附進入流動相中，容量減小［17］。從表2可見，溫度對該化合物的影響主要表現(xiàn)為前一方面。隨著溫度的升高，容量因子增加，但分離度減小。因此確定：在改性劑為10%乙醇、流速3.0 mL/min和背壓為100 bar條件下，分離較佳的柱溫是 308 K，此時的分離度為4.679。

表2　柱上容量因子、選擇性和分離度隨柱溫的變化

2.4背壓的影響

除了改性劑和柱溫外，背壓是影響超臨界流體色譜分離的另一個重要因素。在改性劑為10%乙醇、柱溫是308 K和流速3.0 mL/min的條件下，容量因子、選擇性和分離度變化如表3所示。

表3　柱上容量因子、選擇性和分離度隨背壓的變化

由表3可見，背壓升高，在改性劑為10%乙醇、柱溫是308 K和流速3.0 mL/min的條件下，分離效果最好的是100 bar，此時分離度為4.679。

3　結(jié)論

本實驗在考察了色譜柱種類、改性劑、流動相組成、柱溫和背壓對分離2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的影響，最終確定超臨界流體色譜最佳的分離條件：以Sepax SFC-Pyridine（250 mm ×4.6 mm，I.D.5μm）為色譜柱、改性劑為10%乙醇，流動相流速3.0 mL/min，柱溫 308 K，背壓100 bar，進樣30 μL，在此條件下，兩化合物的分離度可達(dá)4.679。該方法可應(yīng)用于環(huán)境及食品中2，4二叔丁基酚，2，6二叔丁基酚的快速檢測，樣品運行時間短，改性劑用量少且無毒。

圖1　2，4二叔丁基酚和2，6二叔丁基酚的超臨界流體色譜圖Fig.1 Figure title in English Supercritical CO2fiuid chromatogram of 2，4-Ditertbutyl phenol and 2，6-Ditertbutyl phenol

［1］Kveta K，Tereza S，Jiri V，et al.Supercritical fluid chromatography as a tool for enantioselective separation；A review［J］.Anal Chim Acta，2014，（821）:1-33.

［2］ Guiochon G，Tarafder A A.Fundamental challenges and opportunities for preparative supercritical fluid chromatography［J］.J.Chromatogr.A，2011，（1218）:1037-1114.

［3］ Lesellier E.Retention mechanisms in super/subcritical fluid chromatography on packed columns［J］.J.Chromatogr. A，2009，（1216）:1881-1890.

［4］蔣崇文，楊亦文，任其龍，等.超臨界流體色譜法分離生育酚同系物［J］.分析化學(xué)，2003，31（11）:1337-1340.

［5］李振宇，傅青，李奎永，等.超臨界流體色譜對吳茱萸中吲哚類生物堿的快速分析［J］.色譜，2014，32（5）:506-512.

［6］趙穎.2，4-二叔丁基苯酚的制備［J］.化學(xué)工程師，2001，（3）:18-19.

［7］方振煒，徐德強，張亞雷，等.2，6-二叔丁基酚降解菌的降解特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2004，25（3）:98-101.

［8］張志剛，徐德強，李光明，等.固定化菌種降解2，6-二叔丁基酚的研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2005，28（3）:1-2.

［9］張亞雷，方振煒，徐德強，等.生物強化技術(shù)處理2，6-二叔丁基酚的研究［J］.環(huán)境工程，2005，23（6）:32-34.

［10］李丹妮，劉雯雯，練鴻振，等.抗氧劑168的質(zhì)量控制分析及雜質(zhì)鑒定［J］.應(yīng)用化學(xué)，2005，（5）:511-516.

［11］金鐸，麥錦歡，彭旭輝，等.固相膜萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法檢測水體中痕量酚類化合物［J］.分析測試學(xué)報，2015， 34（1）:80-85.

［12］黃穎，陳亮平，陳國南.紫外分光光度法及毛細(xì)管電泳法測定烷基酚與環(huán)糊精的包合常數(shù)［J］.分析測試學(xué)報，2015，34（4）：428-432.

［13］施剛剛，程冬冬，朱勇，等.高效液相色譜法同時測定工業(yè)廢水中的2，4-二叔丁基酚和2，6-二叔丁基酚［J］.浙江化工，2014，45（1）:37-39.

［14］陳偉珠，晉文慧，洪專，等.超高壓液相色譜法測定魚油中的EPA-EE和DHP-EE［J］.食品研究與開發(fā)，2013，34（6）:69-73.

［15］陳偉珠，許鵬翔，易瑞灶，等.超臨界流體色譜法分析非對映異構(gòu)體d4T-5’-N-磷酰化苯丙氨酸甲酯［J］.分析化學(xué)，2012，40（8）:1159-1163.

［16］Han S，Row K.Chiral Separation of Ibuprofen by Supercritical Fluid Chromatography［J］.Chin.J.Chem.Eng.，2005，13（6）:741-746.

Separation of 2，4-Ditertbutyl phenol and 2，6-Ditertbutyl phenol by Supercritical CO2Fluid Chromatography

ZHOU Xu-zhen，RAO Gui-wei， LI Cheng-ping，HUO Po*
（College of Biology and Environmental Engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou，Zhejiang 310015，China）

These isomers 2，4-ditertbutyl phenol and 2，6-ditertbutyl phenol have been separated by supercritical CO2fluid chromatography（SFC）.Orthogonal experiment design was adopted to optimize the method for chromatographic parameters including content of ethyl alcohol（EtOH）in mobile phase of CO2fluids，the type of column，the column temperature and the column pressure on the capacity factor（k‵）and resolution（Rs），and the best conditions for separation were optimizes as follows:using a Sepax SFC-Pyridine column（250 mm×4.6 mm，I.D.5 μm）；the mobile phase as CO2-EtOH（90:10，V/V）at the flow rate of 3 mL/min；the column temperature at 35℃；the column pressure at 100 bar；Uv detection wavelength was 270 nm；30 μL of sample solution injected at the concentration of 1mg/mL.Under these conditions，the separation time was about 5 min，with Rs at 4.68.

supercritical CO2fluid chromatography；2，4-ditertbutyl phenol；2，6-ditertbutyl phenol

1006-4184（2015）12-0048-04

2015-09-11

浙江省教育廳研究項目（Y201432429）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃項目（2014R420030）。

周旭珍（1993-），女，浙江遂昌人，從事色譜檢測工作。E-mail:1197223381@qq.com。

活潑（1962-），博士，教授，研究方向：功能食品開發(fā)及檢測。E-mail:xiankelaifeng@163.com。