寇小霞等

摘要：為了研究不同提取方法對大賴草[Leymus racemosus （Lam.） Tzvel]基因組DNA提取質(zhì)量的影響，以大賴草的嫩葉為材料，采用CTAB法、CTAB改良法、SDS法、SDS-CTAB法4種提取方法提取大賴草葉片基因組DNA，對提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計法檢測，獲得最佳大賴草DNA提取方法，并利用ISSR標(biāo)記驗證其質(zhì)量。結(jié)果表明，改良的CTAB法提取的大賴草基因組DNA純度較高、完整性較好，ISSR擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性高。最終確定CTAB改良法為最佳提取方法，完全適合于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：大賴草[Leymus racemosus （Lam.） Tzvel]； 基因組DNA；提取方法；CTAB 法；CTAB改良法；SDS法；SDS-CTAB法

中圖分類號：Q78；S543+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4324-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.057

大賴草[Leymus racemosus （Lam.） Tzvel]又名巨大濱草、巨野麥，禾本科多年生根莖型草本。主要分布在新疆準(zhǔn)噶爾盆地古爾班通古特沙漠沿額爾齊斯河兩岸的沙丘上及俄羅斯東南部的一些沙漠中[1，2]。大賴草的耐風(fēng)蝕、耐高溫、耐嚴(yán)寒、耐沙埋、抗旱等較強(qiáng)的沙生適應(yīng)特性及其強(qiáng)烈的克隆生長能力和密集的地上、地下構(gòu)件等特征使其成為一種優(yōu)良的固沙植物，對于增加荒漠地表的粗糙度、防風(fēng)固沙等方面有重要的生態(tài)價值[3]，是保護(hù)干旱荒漠化土地的重要生物屏障。然而，由于受自然和人類活動的長期作用，大賴草種群已嚴(yán)重退化成為瀕危物種，迫切需要恢復(fù)與重建。因大賴草穗大、多花、莖稈強(qiáng)壯，具有抗干旱、寒冷、鹽堿和多種病蟲害等特點，國內(nèi)外不少學(xué)者在小麥育種及轉(zhuǎn)基因工作中對大賴草的優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行了大量的應(yīng)用[3-7]，并將大賴草列為改良成多年生谷物或飼料候選物種。劉宇等[8]進(jìn)行了多次野外調(diào)查，發(fā)現(xiàn)種子的初始萌發(fā)時間長，萌發(fā)速率低，雖然穗大、花多，異花受粉且具有自交不親和性[9]，可以產(chǎn)生種子，但其結(jié)實率并不高，種子產(chǎn)量僅為開花數(shù)量的25%左右，且自然生境中干旱少雨、水分缺少，導(dǎo)致種子萌發(fā)后易“閃苗”。這些因素導(dǎo)致大賴草有性繁殖更新率低[10]。目前對大賴草進(jìn)行分子生物學(xué)研究的報道較少，特別是大賴草DNA提取相關(guān)的研究。基因組DNA的提取質(zhì)量直接影響到后期的分子生物學(xué)試驗結(jié)果，為使所得的DNA純度高，斷裂降解程度小、量足，在提取時應(yīng)根據(jù)不同研究需要，保證其結(jié)構(gòu)的相對完整性，盡量排除其他大分子成分如蛋白質(zhì)、多糖等的污染[11]。目前植物基因組DNA提取常用的方法有CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法、高鹽低pH法等[12-15]。針對研究目的和試驗材料的不同，提取植物基因組DNA的方法側(cè)重點也不同，各有其優(yōu)缺點。而獲取高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行限制性酶切、PCR擴(kuò)增、分子雜交、遺傳多樣性分析以及基因組學(xué)等分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。因此，本研究擬通過不同的DNA提取方法比較，旨在獲得提取質(zhì)量較高的大賴草總DNA方法，以期為后續(xù)的分子生物學(xué)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料大賴草于2013年5月采自新疆阿爾泰地區(qū)，用硅膠干燥，帶回實驗室備用。

DNA抽提緩沖液：①CTAB抽提緩沖液。100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA （pH 8.0）、350 mmol/L NaCl、2% CTAB抽提緩沖液、2% β-巰基乙醇。②CTAB改良法抽提緩沖液。溶液Ⅰ：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、2 mmol/L EDTA（PH 8.0）、14 mmol/L NaCl、0.35 mmol/L葡糖糖、PVP40；溶液Ⅱ：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1.4 mmol/L NaCl、2% CTAB、2% PVP40、0.1% VC。③SDS抽提緩沖液。100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、50 mmol/L EDTA（PH 8.0）、500 mmol/L NaCl、3% SDS、2% β-巰基乙醇。④SDS-CTAB抽提緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、50 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20% SDS、40% PVP40。

試驗所使用的試劑均為國產(chǎn)分析純。Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP等均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；ISSR引物選用哥倫比亞大學(xué)公布的UBC815，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

1）CTAB法。稱取0.02 g干燥的大賴草葉子置于液氮中速凍，用研缽磨成細(xì)粉。裝入1.5 mL的Eppendorf管，迅速加入700 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，輕輕混勻，于65 ℃條件下保溫10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上清液移入到新的1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（體積比為24∶1）混合溶液混勻2 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。重復(fù)上一步驟。之后，吸取上清液移入到新管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，于- 20 ℃條件下靜置10 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀1次，待自然風(fēng)干后，加入20 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2）CTAB改良法。稱取0.02 g干燥的大賴草葉子置于液氮中速凍，用研缽磨成細(xì)粉。裝入1.5 mL Eppendorf管，迅速加入700 μL溶液Ⅰ，2%β-巰基乙醇，劇烈振蕩，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清液，迅速加入700 μL溶液Ⅱ及2%β-巰基乙醇，輕輕混勻，65 ℃水浴50 min，期間搖動，4 ℃，12 000 r/min離心5 min。吸取上清液移入到新的1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（體積比為24∶1）混合溶液和200 μL 3 mol/L NaAc溶液，混勻2 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。重復(fù)上一步驟。吸取上清液移入到新管中，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，于-20 ℃條件下靜置20 min，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清。用500 μL 75% 乙醇漂洗沉淀，短暫離心，待自然風(fēng)干后，加入20 μL ddH2O溶解DNA，-20 ℃貯存?zhèn)溆?。endprint

3）SDS法。稱取0.02 g干燥的大賴草葉子置于液氮中速凍，用研缽磨成細(xì)粉。加入650 μL預(yù)熱65 ℃的SDS抽提緩沖液混勻，65 ℃保溫40 min，其間緩慢顛倒4次，取出，于-20 ℃條件下靜置10 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。吸取上清液移入到新的1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（體積比為24∶1）混合溶液緩慢顛倒混勻2 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。重復(fù)上述步驟1次。吸取上清液，加入2倍體積無水乙醇，于-20 ℃條件下靜置20 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀用70%乙醇洗滌2次，待自然風(fēng)干后，沉淀加ddH2O溶解，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

4）SDS-CTAB法。稱取0.02 g干燥的大賴草葉子置于液氮中速凍，用研缽磨成細(xì)粉。加入600 μL預(yù)熱65 ℃的SDS-CTAB抽提緩沖液，臨時加80 μL 20% SDS以及150 μL 40% PVP混勻，65 ℃保溫60 min，其間緩慢顛倒4次，然后于-20 ℃條件下靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，加入等體積三氯甲烷/異戊醇（體積比為24∶1）混合溶液抽提，緩慢顛倒混勻至乳狀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。重復(fù)上述步驟1次。加入2倍體積無水乙醇，于-20 ℃條件下靜置20 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀用70%乙醇洗滌2次，待自然風(fēng)干后，加ddH2O溶解，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA的紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測 用紫外分光光度計測定230、260、280 nm 的吸光度，根據(jù)OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm的比值判斷純度。吸取4 μL DNA，加1 μL上樣緩沖液，在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓80 V，電泳時間20 min，電泳結(jié)果經(jīng)溴化乙錠染色液染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照，檢測其完整性。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 以所選取最佳的方法提取的DNA為模板進(jìn)行ISSR-PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 混合液 0.5 μL，10 mmol/L 引物 0.5 μL，2.5 U Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，30 ng/μL DNA 1 μL， ddH2O 20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延長45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。用ISSR引物UBC815檢驗不同 DNA模板的 PCR 效果，產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果在EB染色液中染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 大賴草DNA樣品的純度鑒定

使用紫外分光光度計分別測定260、280、230 nm波長下4種方法所提DNA樣品的吸光度，每個方法獲取的樣品測3次值，平均結(jié)果見表1。從表1可以看出，用CTAB改良法提取的DNA純度較高、污染度低，為下一步進(jìn)行大批量提取大賴草基因組DNA奠定一定的基礎(chǔ)。

2.2 大賴草DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖1為4種方法提取的大賴草DNA的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。由圖1可以看出，CTAB改良法提取的DNA亮度均勻一致、條帶清晰、整齊、幾乎無拖尾現(xiàn)象，質(zhì)量較好；SDS法與CTAB法提取的DNA出現(xiàn)降解現(xiàn)象且降解嚴(yán)重；而SDS-CTAB法提取的DNA條帶不明顯。相比較而言，改良的CTAB法的提取效果最好，說明該方法對于大賴草中的多糖和次生代謝產(chǎn)物去除效果相對其他3種方法的效果較好，所提取DNA的完整性較好。對CTAB改良法提取DNA的效果進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，CTAB改良法所提取的24份大賴草DNA條帶整齊、完整、無降解，表明其質(zhì)量較高，完全可以滿足后續(xù)試驗需要。

2.3 大賴草DNA樣品的ISSR擴(kuò)增反應(yīng)檢測結(jié)果

以CTAB改良法提取的總DNA為模板，用引物UBC815進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步驗證CTAB改良法所提取DNA的可靠性，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，CTAB改良法提取的總DNA的擴(kuò)增效果圖譜清晰、多態(tài)性高。

3 小結(jié)與討論

植物DNA的提取方法較多，基本上是比較成熟的，但對不同的植物來說，由于其各自的生物化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)不同，在具體操作中存在較大的差異。多酚、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量是DNA提取質(zhì)量的關(guān)鍵影響因素。一般來說，CTAB緩沖液比較適用于草本植物和不含酚類或含酚類較少的植物DNA提取[15，16]。

本研究根據(jù)試驗材料大賴草所具有的特性，選用了4種常見的方法提取了基因組DNA，在試驗過程中為了提高DNA的質(zhì)量，首先，提取前在抽提緩沖液中加入了EDTA、PVP40等能絡(luò)合多種酚類物質(zhì)的試劑，可以防止DNA發(fā)生褐變；其次，加入了β-巰基乙醇以降解蛋白質(zhì)并抑制多種酶的氧化活性；再次，考慮到細(xì)胞裂解的充分性，在水浴的過程中，將水浴時間延長到了50 min；此外，利用三氯甲烷/異戊醇（體積比為24∶1）混合溶液抽提時，可根據(jù)大賴草葉子的老與嫩選擇抽提的次數(shù)，老葉子適當(dāng)增加抽提次數(shù)。如果瓊脂糖凝膠電泳圖譜的點樣孔有殘留雜質(zhì)，說明該DNA樣品中含有較多的未被去除的蛋白質(zhì)、多糖及一些其他次生代謝產(chǎn)物，由于這些物質(zhì)具有黏連特性，常與DNA結(jié)合成復(fù)合物，使得DNA分子無法離開點樣孔或電泳速度較慢。試驗利用ISSR-PCR檢測CTAB改良法提取的基因組DNA質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增效果圖譜清晰、多態(tài)性高，說明此方法在提取的過程中蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)除去的較干凈，從而提高了對PCR反應(yīng)體系中TaqDNA聚合酶的活性以及引物結(jié)合模板的能力。endprint

綜上可知，采用CTAB法、CTAB改良法、SDS法、SDS-CTAB法4種方法提取大賴草葉片基因組DNA時，以CTAB改良法提取的效果最佳，可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

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