呂小玲　管祖東　黃麗琴　李文跡　羅忠寶

（福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司技術(shù)中心　福建光澤　354100）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在檢測(cè)雞肉中環(huán)丙沙星殘留的應(yīng)用

呂小玲管祖東黃麗琴李文跡羅忠寶

（福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司技術(shù)中心福建光澤354100）

建立了雞肉中環(huán)丙沙星的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，試樣經(jīng)EDTA-Na緩沖鹽提取和凈化后，C18柱HPLC進(jìn)行分離，多反應(yīng)選擇離子檢測(cè)。方法的回收率和變異系數(shù)分別在90%～110%和3%～10%。該方法對(duì)雞肉中環(huán)丙沙星檢測(cè)限為1μg/kg。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜環(huán)丙沙星殘留

環(huán)丙沙星為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，具廣譜抗菌活性，殺菌效果好，幾乎對(duì)所有細(xì)菌的抗菌活性均較諾氟沙星及依諾沙星強(qiáng)2～4倍，對(duì)腸桿菌、綠膿桿菌、流感嗜血桿菌、淋球菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌具有抗菌作用，全球廣泛用于治療人類及動(dòng)物的各種細(xì)菌性疾病［1］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)由于濫用該藥導(dǎo)致廢水、生活垃圾等中該藥殘留濃度日益增加［2］，為此我國(guó)農(nóng)業(yè)部、歐盟及日本等為控制合理使用該藥，對(duì)環(huán)丙沙星的最高殘留作了限定性要求［3］。檢測(cè)動(dòng)物源食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法有很多，目前，在雞肉產(chǎn)品的檢測(cè)中，常采用的方法是動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)---高效液相色譜法（農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008）［4］。本研究建立了雞肉中環(huán)丙沙星的高效液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法，該方法準(zhǔn)確、靈敏度高，適合雞肉中環(huán)丙沙星的快速確證分析，以便有效指導(dǎo)臨床用藥，確保食品安全。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑環(huán)丙沙星，含量99.0%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfera公司。乙酸銨、甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，檸檬酸、EDTA-Na為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2儀器與設(shè)備Agilent 6460液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀；吹氮濃縮裝置，北京八方；IKA MS 3 basic微型混合器；水浴恒溫振蕩器等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.3樣品前處理

1.3.1環(huán)丙沙星提取稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中。加入Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液，震蕩提取5 min，以6 000 r/min離心5min。殘留物用15mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液重復(fù)提取1次，合并2次上清液，用快速濾紙過(guò)濾，用一干凈50mL塑料離心管中收集濾液，定容至50mL，待凈化。

1.3.2凈化方法將提取液10 mL過(guò)艾杰爾PEP小柱（150mg/6mL）。a）6mL甲醇+6mL水活化；b）上樣；c）用6mL 5%甲醇淋洗；d）用6mL乙腈洗脫。準(zhǔn)確移取洗脫液于氮?dú)饬飨麓抵两?，用流?dòng)相定容至1mL，過(guò)0.22μm微孔濾膜，置2mL樣品瓶中。

1.4儀器參數(shù)與測(cè)定

1.4.1色譜測(cè)定條件a）色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，3.5μm×100 mm×2.1mm（id）；b）流動(dòng)相：0.1%甲酸乙腈：0.005mol/L乙酸銨水溶液=13∶87。c）柱溫：35℃；d）進(jìn)樣量：5μL。e）接口及離子化方式：ESI+AJS，正離子檢測(cè)。干燥氣10 L/min，干燥溫度350℃，鞘氣12 L/min，鞘氣溫度250℃，氣體均為氮?dú)?；電離電壓：4 000 V，各離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能CE見(jiàn)表1。

表1　質(zhì)譜參數(shù)

1.4.2質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到準(zhǔn)分子離子峰 （M+1）即m/z332.0，優(yōu)化去簇電壓。對(duì)m/ z332.0進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，優(yōu)化碰撞電壓，然后對(duì)離子源溫度、霧化氣、氣簾氣等進(jìn)行優(yōu)化。再以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）負(fù)離子模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞電壓、碰撞室入口及出口電壓等質(zhì)譜參數(shù)。分別選擇豐度較強(qiáng)的2個(gè)子離子為特征離子，以母離子與子離子組成監(jiān)測(cè)離子對(duì)，進(jìn)行定性和定量分析。

2.2樣品前處理?xiàng)l件的選擇雞肉中富含蛋白和脂肪，基質(zhì)干擾復(fù)雜，合適的前處理方法可以將待測(cè)組分與樣品雜質(zhì)較好地分開(kāi)。本試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)待測(cè)組分的性質(zhì)選擇EDTA-Na檸檬酸緩沖鹽溶液提取，本試驗(yàn)對(duì)比3種不同pH（3.0、4.0、7.0）緩沖鹽以及乙腈、0.1%甲酸乙腈作為提取液的提取效率，結(jié)果表明（見(jiàn)表2），pH4.0緩沖鹽和乙腈提取較好，但有機(jī)試劑乙腈對(duì)人體及環(huán)境污染較大，故最終選用pH4.0緩沖鹽作為提取液。該方法提取效率高、雜質(zhì)少、回收率高、前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，所采用有機(jī)試劑少，避免污染。

表2　不同提取液對(duì)雞肉樣品中添加環(huán)丙沙星提取回收率的影響（n=3）

2.3方法的定量限、回收率、重復(fù)性及線性范圍在以上確定的測(cè)定條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)系列（n=6），分析化合物的濃度比為X軸，以分析物的峰面積比為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，環(huán)丙沙星濃度在1～20 μg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)和回歸方程為Y=2445.869948*X+573.162374，r2=0.992。在空白樣品中添加環(huán)丙標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3個(gè)水平濃度的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1　空白雞肉樣品離子圖

圖2　添加1μg/kg環(huán)丙沙星樣品離子圖

3　結(jié)　論

表3　雞肉樣品添加回收率及精密度測(cè)試結(jié)果（n=6）

雞肉中的環(huán)丙沙星殘留可利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行快速測(cè)定，該方法非常適合于雞肉中環(huán)丙沙星的快速定量定性分析，在1.0～100μg/kg添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為92%～105.2%，相對(duì)偏差為3.8%～9.4%，方法檢測(cè)限等指標(biāo)滿足國(guó)內(nèi)外檢測(cè)的相關(guān)要求。

［1］Bhandari A，Close L I，Kim W J，et al.Occurrence of ciprofloxacin，sulfamethoxazole，and azithromycin in municipal wastewater treatment plants［J］.Practice Periodical of Hazardous，Toxic，andRadioactiveW asteManagement， 2008，12（4）：275-281.

［2］Carmosini N，Lee L S.Ciprofloxacin sorption by dissolved organic carbon from reference and bio-waste materials［J］. Chemosphere，2009，77（6）：813-820.

［3］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)［EB/OL］. （2002-12-24）.http：//yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

［4］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)：高效液相色譜法［S］.農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-14-2008.

Determ ination of the residues of ciprofloxacin in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Lv Xiaoling Guan Zudong Huang Liqin LiWenji Luo Zhongbao
（Fujian sunner development CO.，LTD.，Guangze 354100）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the quantitative determination of Ciprofloxacin respectively in the chicken.The ciprofloxacin in chicken were deproteinated with EDTANa Mcllvaine buffer followed by liquid-liquid extraction.Further clean-up was performed by solid phase extraction（SPE）through mixed mode columns（PEP-2 SPE）.The separation of the compounds was carried on a Agilent Eclipse Plus C18 column（C18，3.5 μm×100mm×2.1mm（id）by a gradient elution using 0.1%formic acid acetonitrile and 0.1%formic acid water asmobile phases.The analyzes were detected by tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring（MRM）mode with negative electrospray ionization.The ciprofloxacin quantified by internal standard method.The linear ranges were 1.0～20.0μg/L and the correlation coefficients were not less than 0.992.The average recoveries and relative standard deviations ranged from90%～110%and 3%～10%respectively at the spiked levels of 1，2 and 10μg/kg for the bothmarkers.The limit of quantitation（LOQ）was 1μg/kg.Themethod is sensitive，accurate and suitable for the determination and confirmation of chloramphenicols in chicken and eggs.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）ciprofloxacin residue chicken

A

1003-4331（2015）02-0018-03

福建省區(qū)域科技重大項(xiàng)目（2012N 3011）“規(guī)?；子鹑怆u肉品生產(chǎn)獸藥殘留監(jiān)控技術(shù)的研究與應(yīng)用”資助。