伍尚敏，蘇曉三，洪曉婭，左萬昌，王　惠

（昆明市第一人民醫(yī)院暨昆明醫(yī)科大學附屬甘美醫(yī)院整形外科　云南 昆明　650101）

·皮膚美容·

地塞米松、平陽霉素對血管瘤內(nèi)皮細胞的作用

伍尚敏，蘇曉三，洪曉婭，左萬昌，王惠

（昆明市第一人民醫(yī)院暨昆明醫(yī)科大學附屬甘美醫(yī)院整形外科云南 昆明650101）

目的：觀察地塞米松(Dexamethason,DX)、平陽霉素(Pingyangmycin,PYM)對體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細胞(Hemangioma endothelial cell,HEC)生長的抑制作用。方法：以MTT法檢測PYM、DX作用于HEC細胞活性并篩選有效濃度。以有效濃度的PYM、DX作用于HEC，光鏡下觀察HEC形態(tài)，MTT檢測細胞活性，流式細胞術檢測細胞周期并計算細胞增殖指數(shù)（PI）。結果：藥物作用后，光鏡下見HEC發(fā)生壞死改變。MTT檢測顯示吸光度降低（＜0.05）。流式細胞術檢測示內(nèi)皮細胞G1期細胞比例增多（＜0.05）；S期細胞比例下降（＜0.05）；G2期細胞比例下降（＜0.05）。兩種細胞的PI均降低（＜0.05）。結論：PYM和DX可直接損傷DNA，阻滯細胞周期；PYM可直接殺傷HEC，DX使細胞皺縮成圓形，細胞連接中斷，從而抑制血管生成和中斷血管的連續(xù)性。相比較，PYM對HEC的抑制作用較強。

血管瘤；平陽霉素；地塞米松

血管瘤和血管畸形的治療方法很多[1]，主要有口服或局部注射糖皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物局部注射、口服干擾素、激光治療、硬化劑注射治療、放射治療等，但各有其局限性。目前,對平陽霉素和地塞米松治療血管瘤的知識主要來自于臨床療效觀察和少數(shù)細胞水平的研究，其中研究所選細胞均為正常血管的內(nèi)皮細胞，與增生期血管瘤內(nèi)皮細胞增殖活躍是不同的，因此其研究針對性強。本研究通過體外培養(yǎng)HEC，將目前臨床常用的PYM和DX進行干預實驗，以期觀測這兩種藥物的藥效及作用機制，為下一步的基礎和臨床研究工作提供一定的科研依據(jù)。

1　材料和方法

1.1研究對象

收集筆者醫(yī)院和昆明醫(yī)科大學附屬二院整形外科2009年10月-2011年12月經(jīng)手術切除的18例皮膚血管瘤（原稱草莓狀血管瘤）組織，其中男7例，女11例，年齡40天～8歲，平均為1歲2個月。血管瘤標本在切除后半小時內(nèi)送實驗室。

1.2方法

1.2.1 HEC的原代培養(yǎng)及傳代：將無菌標本送細胞培養(yǎng)室，于超凈工作臺（蘇州蘇凈集團）內(nèi)去除皮膚和脂肪組織，用D-Hank's液沖洗后剪切成1mm× 1mm×1mm大小的組織塊，將組織塊置入培養(yǎng)瓶內(nèi)行組織塊法原代培養(yǎng)，并行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PYM、DX對HEC增殖抑制的檢測：采用MTT法檢測不同濃度的PYM、DX對HEC增殖的抑制作用并確定最適濃度。選取3～5代的HEC，常規(guī)傳代以細胞密度約5×106/孔分別接種于3塊96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液100μl，移入37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24h。細胞生長至鋪滿80%孔底后，實驗組加入6個不同濃度梯度的PYM（1×10-2μg/m1～1× 103μg/m1）、DX（1×10-5μg/m1～1×100μg/m1）培養(yǎng)液，每個濃度設5個復孔，并設陰性對照孔（未加藥物）和空白孔（無細胞），3塊板繼續(xù)培養(yǎng)不同時間（12h、24h、36h）后進行MTT實驗。先吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20μl，37℃、5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加 DMSO 150μl，在酶標儀內(nèi)振蕩10min，于492nm波長處測定各孔吸光度（A值）。每組實驗重復5次，取平均A值。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。根據(jù)以下公式計算各個藥物濃度的細胞存活抑制率：抑制率=（1-加藥細胞A值/對照細胞A值）× 100%。通過藥物濃度和相應的抑制率計算半抑制率IC50，光鏡下觀察細胞改變。最后確定最適濃度為PYM102μg/m1、DX 100μg/m1，光鏡下觀察細胞改變。

1.2.3流式細胞儀檢測HEC周期各個時相的分布：將3～5代的HEC置入培養(yǎng)瓶內(nèi)傳代，待細胞貼壁后加入無血清M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h。分三組進行如下實驗：實驗組分別加入1×102μg/m1的PYM、1μg/m1的DX；陰性對照組加入含10%胎牛血清M199培養(yǎng)液；空白對照組加入PBS液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用胰酶消化制成單細胞懸液（1.0× 105/ml），離心沉淀，PBS漂洗，70%乙醇固定，4℃保存，送檢。

1.3統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0醫(yī)學統(tǒng)計軟件包作統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以±表示，進行單因素方差分析和均數(shù)間的多重比較。檢測水準均為=0.05。

圖1　M199對照組EC呈典型的“鵝卵石”樣形態(tài)，×100

圖2　PYM作用后EC大量崩解壞死，可見彌散顆粒狀壞死細胞輪廓，×100

圖3　DX作用后EC皺縮成圓形，輪廓較為完整，×100

2　結果

2.1形態(tài)學觀察

藥物作用后，與 M199組比較，HEC均發(fā)生壞死改變（見圖1～3），PYM作用后，細胞出現(xiàn)明顯彌漫性崩解和大量壞死脫落，可見彌散顆粒狀壞死細胞輪廓。DX作用后，細胞皺縮成圓形，細胞整體輪廓較為完整。

2.2 EC活性及最適濃度選擇：HEC經(jīng)藥物作用后吸光度（A）變化及生長曲線、抑制率見表1～2、圖4～6。

表1　不同濃度PYM作用后HEC吸光度變化?。ā溃?/p>

表2　不同濃度DX作用后HEC吸光度變化 （±）

觀測發(fā)現(xiàn)102μg/m1的PYM抑制細胞生長的作用最強。在102μg/m1組，12h、24h，12h、36h差異有統(tǒng)計學意義，12h抑制率（圖3～5）即超過50%，隨后的24h、36h抑制率基本持平，接近75%，說明細胞PYM的抑制作用具有時間依賴性，在最初12h至 24h作用明顯呈直線上升趨勢，到達24h后作用較為穩(wěn)定，處于平臺期。因此，在臨床上可在一定的時間后追加藥物鞏固治療效果。

觀測發(fā)現(xiàn)100μg/m1的DX抑制細胞生長的作用最強，細胞吸光度在逐漸下降。而在其他組只在最初的12h起作用，隨后吸光度變化不是很明顯，說明這些濃度的DX維持作用時間很短暫。在100μg/m1組，12h與24h，12h與36h差異有統(tǒng)計學意義，12h起明顯效果，到24h抑制率（圖4）成倍增長，說明DX在最初12h至24h這段時間作用最為強烈，24h后抑制作用基本維持不變。結果提示，PYM對HEC的抑制作用較強。

2.3細胞周期分布

流式細胞術檢測的細胞周期分布及計算細胞增殖指數(shù)[（proliferation Index，PI）PI=(S+G2/M)/ (S+G2/M+G0/G1)×100%]見表3。

流式細胞術檢測結果示：在兩種藥物作用下，HEC G1期細胞比例增多（＜0.05），S期細胞比例下降，G2期細胞比例下降（＜0.05）。

圖4　不同藥物對HEC的抑制率　

圖5　PYM作用后HEC的生長曲線

圖6　DX作用后HEC的生長曲線

3　討論

血管瘤是嬰幼兒最常見的一種良性腫瘤，可發(fā)生于身體的任何部位，頜面部尤其好發(fā)。位于顏面部或在增殖期出現(xiàn)并發(fā)癥，則需要及早治療。目前針對血管瘤和血管畸形常見的治療藥物為平陽霉素，而地塞米松常用于嬰幼兒血管瘤的治療，另外還有很多藥物用于血管瘤和血管畸形的治療，但療效并不確切。

傳統(tǒng)觀點認為PYM治療血管瘤的機制是迅速抑制血管內(nèi)皮細胞增生促進血管瘤消退，局部高濃度藥物可直接破壞血竇內(nèi)皮，進而抑制血管瘤的發(fā)展。之后的研究表明，PYM可對血管內(nèi)皮細胞及管壁組織產(chǎn)生非特異損傷，伴隨有血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及肌成纖維細胞的增生，使管壁增厚，使瘤腔縮窄、閉鎖，最后發(fā)生機化[2]。血管瘤瘤體具有幼稚胚胎血管內(nèi)皮特征，瘤體內(nèi)注射平陽霉素可迅速抑制內(nèi)皮細胞增生，促使血管瘤消退。平陽霉素對血管內(nèi)皮細胞無選擇性，可使正常血管壁增厚，血管腔閉合[3]。筆者[4]之前的研究提示PYM可有效抑制HEC的生長和增殖，可能是通過抑制HEC DNA的合成及抑制其分泌音猬因子Shh，從而抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及血管生成。

表3　PYM和DX作用后 HEC的細胞周期分布及細胞增殖指數(shù)?。╪=5）

表3　PYM和DX作用后 HEC的細胞周期分布及細胞增殖指數(shù)　（n=5）

注：*與M199比較，＜0.05

組別M199 PYM DX G1（%）33.9±3.31 46.4±4.63*46.7±3.39*S（%）21.5±1.95 45.3±2.05*18.7±0.65*G2（%）44.1±2.46 8.5±3.24*35.2±2.37*PI（%）66.1 52.5*54.0

近年來發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)類固醇激素對多種細胞的增殖有抑制作用，其生物學效應是通過GR介導的，即激素和受體結合形成激素-受體復合物后，與靶基因中的皮質(zhì)激素反應元件相互作用，從而促進或抑制基因表達，最終產(chǎn)生生物學效應。由于GR是介導皮質(zhì)激素作用的關鍵因素，因此，其表達水平可直接影響靶細胞對皮質(zhì)激素的反應性[5]。體外細胞培養(yǎng)研究表明皮質(zhì)類固醇激素能非常明顯地抑制血管瘤血管內(nèi)皮細胞的增殖[6]。DX可有效抑制HEC的增殖，可能通過該抑制HEC分泌MMP-2，從而抑制了內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管的形成[7]。

在本實驗中，觀察到在PYM組可看到較低濃度的PYM對HEC即表現(xiàn)出一定的抑制作用，當濃度達到102μg/m1時，其抑制作用明顯增強，在最初12h時其IR達到56%，到24h時達74%，隨后保持基本穩(wěn)定狀態(tài)，在36h時，IR為2%。顯微鏡下觀察，可見在PYM作用后，細胞皺縮，隨著作用時間的延長，細胞出現(xiàn)明顯彌漫性崩解和大量壞死脫落，可見彌散顆粒狀壞死細胞輪廓。提示細胞間連接受損和細胞死亡，說明PYM較強的致?lián)p傷藥效能持續(xù)抑制HEC的生長。HEC受損后，細胞即發(fā)生不可逆性收縮，緊密連接結構消失，細胞間隙增大，大量壞死物質(zhì)釋放入周圍間質(zhì)。而HEC的收縮及其間隙增大后，血管壁通透性隨之增高。提示PYM作用于HEC及血管壁后，HEC損傷及血管的通透性增高和大量壞死物質(zhì)釋放入周圍間質(zhì)，可部分解釋PYM在臨床應用過程中產(chǎn)生的早期局部腫脹現(xiàn)象及后期出現(xiàn)的局部病損區(qū)瘢痕色素形成現(xiàn)象。而在DX組可見，較低濃度的DX對HEC即表現(xiàn)出一定的抑制作用，當濃度為100μg/m1時，其抑制作用明顯增強。12h時其IR 為34%，到24h時達73%，隨后保持基本穩(wěn)定狀態(tài)，在36h時，IR為74%。其作用形態(tài)學結果提示DX作用的最初12h早期，HEC出現(xiàn)輕微收縮現(xiàn)象，隨著作用時間的延長，細胞皺縮成圓形，細胞整體輪廓較為完整，這在一定程度上可以解釋臨床使用過程中，局部注射后無明顯炎癥反應這一現(xiàn)象。

本實驗流式細胞術檢測結果提示，在這兩種藥物作用下，HEC：①出現(xiàn)凋亡峰，說明凋亡參與了藥物對HEC的作用；② PI降低（＜0.05），說明這兩種藥物均可抑制HEC的增殖；③G1期細胞比例增多（＜0.05），提示細胞周期被阻滯于G1期；④S期細胞比例下降（＜0.05），提示HEC的增殖活力強；⑤G2期細胞比例下降（＜0.05），提示藥物對HEC DNA的直接損傷作用。

綜合以上形態(tài)學觀察、IR及PI、細胞周期阻滯結果，提示PYM可以抑制DNA合成，DX作用后則使DNA合成減少，即PYM和 DX對細胞的作用不僅有抑制DNA合成，促進凋亡，還有對DNA的直接殺傷作用也參與了其過程。細胞凋亡（apoptosis）是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因控制的細胞主動死亡過程。PYM、DX作用后的HEC均可見凋亡峰的出現(xiàn)，提示凋亡參與了各藥物發(fā)揮藥效的過程，但其凋亡是通過哪些途徑，是如何作用的，尚需進一步證實。

［1］伍尚敏，魯開化.血管瘤藥物治療的現(xiàn)狀［J］.中國美容醫(yī)學，2007，16（1）：133-137.

［2］鄭根建，高慶紅，周嵐，等.平陽霉素白蛋白微球?qū)ρ軆?nèi)皮細胞形態(tài)的影響［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2005，21（4）：514.

［3］李平，周水淼，鄭宏良，等.平陽霉素對體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的作用［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2006，13（1）：13-15.

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［7］伍尚敏，張蔓菁，劉賓，等.地塞米松對血管瘤內(nèi)皮細胞分泌MMP-2的影響［J］.中國美容醫(yī)學，2010，19（11）：1645-1648.

編輯/李陽利

The role of Pingyangmycin and Dexamethason on hemangioma endothelial cell

WU Shang-min,SU Xiao-san,HONG Xiao-ya,ZUO Wan-chang,WANG Hui
（Department of Plastic Surgery,the First People's Hospital of Kunming,The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650101,Yunnan,China)

ObjectiveTo investigate the function of PYM and DX on HEC.MethodsTo primary culture HEC.Different dosage of PYM and DX were applied in the HEC,and the effective concentration of PYM and DX were examined by MTT method.The morphous of HEC was observed by photology inverted microscope,the cytoactive was detected by method of MTT and the cell cycle was investigated by flow cytometry（FCM）.Results HEC were necrosis under the role of PYM and DX, many cells debris can be seen under the light microscope.The MTT absorptance decreased after treatment(＜0.05).The analysis of cell cycle in HEC showed that the percentage of G1 phase cells increased(＜0.05)and that of G2cells phase decreased(＜0.05)in two groups,and the percentage of S phase decreased（＜0.05）.The PI of two groups decreased(＜0.05),compared with the normal contro1.Conclusion HEC can be arrested before enters the DNA compose stage by all two drugs.All two drugs can induce HEC apoptosis and can change the morphous of HEC,and prevent the HEC mixed tighter to form blood vessel.PYM and DX have the ability to injury the DNA directly,and that take part in the blockage of cell cycle.DX arrests HEC enters the replication stage and inhibits cells proliferation.PYM and DX inhibit HEC proliferation and growth by arresting DNA composing.

Hemangioma endothelial cell；Dexamethason；Pingyangmycin

R732.2

A

1008-6455（2015）01-0030-04

云南省教育廳科學研究基金項目（2010C098）

2014-11-17

2014-12-23