周樹偉，蘇蓓蓓，周　勇

（1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院頭頸乳腺科　河南　新鄉(xiāng)　453000；2.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚科　河南　新鄉(xiāng)　453000）

·基礎(chǔ)研究·

PUMA蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)和意義

周樹偉1，蘇蓓蓓2，周勇1

（1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院頭頸乳腺科河南新鄉(xiāng)453000；2.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院皮膚科河南新鄉(xiāng)453000）

目的：探討PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis，P53上調(diào)凋亡調(diào)控因子)蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義。方法：采用免疫組化SP法觀察36例皮膚鱗癌組織和25例正常皮膚組織石蠟標(biāo)本中PUMA蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）組織中PUMA蛋白陽性表達(dá)率（25.18%）明顯低于正常皮膚組織（78.00%）（＜0.05）；SCC中低分化組的PUMA蛋白的陽性表達(dá)率低于高分化組（＜0.05）。結(jié)論：PUMA蛋白表達(dá)下調(diào)可能使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）；PUMA；免疫組化

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,SCC)是一種常見于頭面部的惡性腫瘤，隨著社會的發(fā)展，其已成為頭頸外科及整形外科的一種常見病。PUMA是Yu等[1]于2001年發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族BH3-only亞家族中的成員之一，因其可被p53快速誘導(dǎo)并具有強(qiáng)大的促凋亡作用而得名。鑒于其在p53依賴與非依賴途徑的細(xì)胞凋亡啟動和腫瘤發(fā)生過程中有重要作用，遂漸成近來研究的熱點(diǎn)之一。但目前在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中PUMA蛋白的表達(dá)情況及與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的病理特征之間的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究采用免疫組化SP法，通過對PUMA蛋白在SCC及正常皮膚組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，為探討它們在SCC發(fā)生發(fā)展中的意義提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1研究對象：石蠟組織選用我院病理科2007年3 月-2014年6月切除且病理確診的皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織36例，年齡47～80歲 (平均66.4歲)，男20例，女16例；組織學(xué)分級：高分化16例、中分化11例、低分化9例；患者無合并皮膚病、結(jié)締組織病、免疫系統(tǒng)疾病及其它重要臟器疾??；患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療、免疫、冷凍、激光等治療。25例正常皮膚組織（對照組）為我院頭頸乳腺科非癌患者術(shù)中修剪或行全厚皮移植時(shí)經(jīng)修剪剩余的全厚皮。

1.2主要試劑：鼠抗人PUMA單克隆抗體（濃縮型）、SP免疫組化試劑盒（濃縮型）均購自北京中杉金橋生物科技公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化：采用免疫組化SP法，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用PBS液代替一抗作陰性對照，用已知的陽性切片作陽性對照，PUMA蛋白（工作濃度為1:50）染色陽性反應(yīng)信號呈棕黃色細(xì)小顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于胞膜。

1.3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.3.3判斷標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)著色的強(qiáng)弱，染色強(qiáng)弱以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)：不著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；②先在低倍鏡下選取細(xì)胞分布均勻的視野，再在高倍鏡視野下用CMIAS病理彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出陽性細(xì)胞的百分比，用%表示即：陽性細(xì)胞率=(陽性細(xì)胞數(shù)/500)×100%。然后根據(jù)陽性細(xì)胞百分比記分＜10% 為0分，10%～45%為1分，46%～70%為2分，＞70% 為3分。根據(jù)上述兩項(xiàng)的記分之和將PUMA蛋白結(jié)果記為：陰性（-），陽性（+～+++）。

2　結(jié)果

正常皮膚及SCC中PUMA蛋白的表達(dá)情況PUMA蛋白在正常皮膚及SCC中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。在正常皮膚組織中的表達(dá)陽性率為76.00%，在SCC中的表達(dá)陽性率為30.56%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.05)。PUMA蛋白的表達(dá)與SCC臨床病理特征之間的關(guān)系見表1。

圖1　PUMA在皮膚鱗癌和正常皮膚中表達(dá)情況，顯微鏡下圖片（400×）

表1　正常皮膚及SCC組織中PUMA蛋白的表達(dá)

3　討論

2001年，YU等[1]采用SAGE(sefial analysis gene expression)技術(shù)、Nakano[2]用微陣列技術(shù)分別從人類成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞系中分離出了一種新的具有促凋亡作用的p53靶基因，命名為PUMA；同年Han[3]等用酵母雙雜交技術(shù)在研究人淋巴細(xì)胞Bcl-2結(jié)合元件時(shí)從cDNA文庫中分離出來與PUMA序列相同的基因，稱為Bbc3（Bcl-2 binding component 3)。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis，P53上調(diào)凋亡調(diào)控因子)蛋白是Bcl-2蛋白家族中BH3-only亞家族的一員，僅含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，定位于線粒體外膜，BH3-only蛋白是介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞凋亡反應(yīng)的基本因子[4]。PUMA蛋白可以被P53快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄且其編碼的蛋白具有強(qiáng)大的促進(jìn)凋亡作用。有研究表明PUMA在正常和異常細(xì)胞的p53依賴與非依賴的凋亡途徑及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并且比p53的促凋亡作用更加強(qiáng)大和穩(wěn)定，因此PUMA在近年腫瘤基因治療的研究中受到廣泛關(guān)注[5]。PUMA在多種組織中低表達(dá)，在腫瘤組織中的表達(dá)更低[1]，在早期卵巢癌中只有43%的卵巢癌細(xì)胞PUMA表達(dá)強(qiáng)陽性，而p53陽性同時(shí)PUMA弱表達(dá)的卵巢癌患者具有更短的無病生存期[6]。Roberts CG等[7]發(fā)現(xiàn)PUMA蛋白在乳腺癌中為低表達(dá)；Karst等[8-9]發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中PUMA表達(dá)明顯降低，并且轉(zhuǎn)移性黑色素瘤較非轉(zhuǎn)移性表達(dá)更低；PUMA表達(dá)減弱或缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和5年生存率明顯相關(guān)。相關(guān)研究結(jié)果還表明PUMA表達(dá)缺失還與黑素瘤大小及分期相關(guān)。Yeh CC等[10]研究發(fā)現(xiàn)人類口腔癌中PUMA的表達(dá)陽性率較低，且在人類口腔癌的小鼠模型中，通過PUMA基因的轉(zhuǎn)移治療可降低腫瘤負(fù)荷并延長小鼠的生存期。將攜帶PUMA的重組脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染頭頸部鱗癌JHU-012和JHU-013細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，PUMA可顯著抑制癌細(xì)胞的克隆[11]。裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PUMA具有抑制腫瘤生長的作用[12]；薛曉婕等[13]通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)46例宮頸癌中，PUMA的表達(dá)僅13例(32.5%)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。提示PUMA的低表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。

吳曙輝等[14]發(fā)現(xiàn)在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PUMA的陽性率為62.5%，顯著低于癌旁組織的84.6%；且其陽性表達(dá)與喉鱗癌的分化程度、有無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)，認(rèn)為PUMA蛋白的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、侵襲性和預(yù)后有一定關(guān)系。本研究顯示PUMA在SCC中的陽性率為30.56%，明顯低于正常皮膚組的76.00%，其原因可能與腫瘤組織中存在的PUMA基因表達(dá)降低或缺失有關(guān)。同時(shí)，筆者的研究也發(fā)現(xiàn)中低分化標(biāo)本中PUMA蛋白的表達(dá)（9.9%）較高分化標(biāo)本中的表達(dá)（62.50%）低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能也是筆者與張曉等[15]的不同之處。

總之，本研究通過分析從正常皮膚到SCC組織PUMA蛋白表達(dá)陽性率的變化，揭示其可能與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的惡性程度或患者預(yù)后相關(guān)，有可能作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。皮膚鱗癌為皮膚科常見惡性腫瘤，隨著環(huán)境的變化，其發(fā)病率有進(jìn)一步升高的趨勢，嚴(yán)重威脅患者的健康與生活質(zhì)量；相關(guān)研究提示對PUMA的檢測可能有助于SCC的早期診斷，并可能作為治療SCC的一個(gè)新的靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)。筆者僅用免疫組化法從蛋白水平研究了正常皮膚組織和SCC中PUMA的表達(dá)情況，對于該基因的具體調(diào)控機(jī)制與在腫瘤治療中的應(yīng)用等方面的問題有待深入研究。

［1］Yu J，Zhang L，Hwang PM，et a1.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells［J］.Mol Cell，2001，7（3）：673-682.

［2］Nakano K，Vousden KH.PUMA，a novel proapoptotic gene，is induced by p53［J］.Molecular Cell，2001，7（3）：683-694.

［3］Han J，F(xiàn)lemington C，Houghton AB，et a1.Expression of bbc3，a pro-apoptotic BH3-only gene，is regulated by diverse cell death and survival signals［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（20）：11318-11323.

［4］Adams JM，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer developmentandtherapy［J］.Oncogene，2007，26（9）：1324-1337.

［5］WangR，WangX，LiB，et a1.Tumor-specificadenovirus-mediated PUMA gene transfer using the survivin promoter enhances radiosensitivety of breast cancer cells in vitro and in vivo［J］. BreastCancerResTreat，2009，117（1）：45-54.

［6］Skfrnisd6ttir I，Seidal T.The apoptosis regulators p53，bax and PUMA：Relationship and impact on outcome in early stage（FIGOⅠ-Ⅱ）ovarian carcinoma after post-surgical taxane-based treatment［J］.Oncol Rep，2012，27（3）：741-747.

［7］Roberts CG，Millar EK，O'Toole SA，et a1.Identification of PUMA as an estrogen target gene that mediates the apoptotic response to tamoxifen in human breast cancer cells and predicts patient outcome and tamoxifen responsiveness in breast cancer［J］.Oncogene，2011，30：3186-3197.

［8］Karst AM，Dai DL，Martinka M，et a1.PUMA expression is significantly reduced in human cutaneous melanomas［J］. Oncogene，2005，24（6）：1111-1116.

［9］Karst AM，Dai DL，Cheng JQ，et a1.Role of p53 up-regulated modulator of apoptosis and phosphorylated Akt in melanoma cell growth，apoptosis，and patient survival［J］.Cancer Res，2006，66（18）：9221-9226.

［10］Yeh CC，Hsieh HL，Lee J，et a1.Polyethylenimine-mediated puma gene delivery to orthotopic oral cancer：suppression of tumor growth through apoptosis induction in situ and prolonged survival［J］.Head Neck，2011，33（6）：878-885.

［11］Hoque MO，Begum S，Sommer M，et a1.PUMA in head and neck cancer［J］.Cancer Lett，2003，199（1）：75-81

［12］Yu J.PUMA kills stem cells to stall cancer［J］.Mol Cell Pharmacol，2009，1（3）：112-118.

［13］薛曉婕，劉佳佳，謝華福.Mcl-1和PUMA在宮頸癌中表達(dá)的初步研究［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（8）：827-828.

［14］吳曙輝，江孝清，龔齊.PUMA，Bcl-2在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及l(fā)臨床意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（9）：89-90.

［15］張曉，王永，李生存，等.PUMA蛋白在日光性角化病及皮膚鱗癌中的表達(dá)及意義［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2004，28 （5）：454-456.

編輯/張惠娟

The expression and significance of PUMA protein in cutaneous squamous cell carcinoma

ZHOU Shu-wei1,SU Bei-bei2,ZHOU Yong1
(1.Department of Head and Neck Breast Surgery,Xinxiang Central Hospital,Xinxiang 453000,China；2. Department of dermatology,Xinxiang Central Hospital,Xinxiang 453000,Henan,China)

Objective To investigate the expression and significance of PUMA protein in cutaneous squamous cell carcinoma.Methods Expression of PUMA protein was detected in 36 SCC and 25 normal skin specimens by SP immunohistochemical technique.Results The positive rate of PUMA protein was significantly lower in SCC(41.18%)than that in normal skin(100%)(<0.05).The positive rate of P-ERK was significantly higher in SCC(76.47%)than that in normal skin(20.00%)(<0.05).The positive rate of PUMA protein in the low differentiation group were lower than it in the high differentiation group(<0.05).Conclusion The decrease or deletion of PUMA protein expression will result in the malignant transformation and proliferation.

cutaneous squamous cell carcinoma;PUMA;Immunohistochemistry

R739.5

A

1008-6455（2015）01-0027-03

2014-11-08

2014-12-23