許振國楊文穎趙崢輝吳銀玲葛少欽,

1. 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部（保定 071000）；2. 保定市競秀區(qū)醫(yī)院；3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所；4. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科；5. 河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

·臨床經(jīng)驗(yàn)·

不同形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)研究*

許振國1△楊文穎1,2△趙崢輝1吳銀玲1葛少欽1,3-5**

1. 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部（保定 071000）；2. 保定市競秀區(qū)醫(yī)院；3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所；4. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科；5. 河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

據(jù)報(bào)道，世界范圍內(nèi)約有15%～20%的育齡夫婦不能生育，且近半個世紀(jì)以來，隨著全球污染問題的日益嚴(yán)重，社會競爭壓力的日趨增加，生活步伐節(jié)奏的不斷加快，男性生殖健康正受到嚴(yán)重威脅，男性精子數(shù)量幾乎減少了一半，并且，還以每年2.1%的速度在減少。同時，畸形、劣質(zhì)精子比例逐漸增多，精子活力、穿透力、致孕率在不斷下降，致使男性不育的比例正在逐年上升。精液分析在診斷男性不育及輔助生殖方面起到越來越重要的作用，精液分析主要包括了精子形態(tài)、精子活力和精子密度等。隨著染色技術(shù)的發(fā)展和畸形精子分類體系的形成，精子形態(tài)學(xué)檢查對不孕不育癥診斷、生育能力預(yù)測以及公共健康研究有重要意義，比精子密度、精液質(zhì)量和運(yùn)動性更能在受孕中起到預(yù)測作用[1]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，不育男性精子不僅存在光鏡形態(tài)學(xué)異常和免疫動力學(xué)改變，而且精子的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了病理性改變。精液常規(guī)分析不能全面反映精子受精能力，而且已經(jīng)不能滿足日益發(fā)展的輔助生殖技術(shù)的需要。目前輔助生殖技術(shù)在治療男性不育時尚沒有對電鏡下不同形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)研究，沒有對光鏡下不同頭部形態(tài)精子通過其電鏡下超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量評價(jià)。為全面評價(jià)精子受精能力，電鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)是必要的[2]。本實(shí)驗(yàn)室通過對不同頭部形態(tài)精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，總結(jié)了不同頭部形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并依據(jù)其超微結(jié)構(gòu)缺陷對精子進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

材料與方法

1. 試劑：瓊脂糖，戊二醛，鋨酸，Epon812樹脂，甲苯胺藍(lán)，醋酸鈾，檸檬酸鉛。

2. 主要儀器：JEM-100SX透射電鏡（75kV）（由日本電子公司生產(chǎn)）；Olympus-II光學(xué)顯微鏡（由日本Olympus公司生產(chǎn)）； TEM ULTRACUT E（701704）超薄切片機(jī)（由澳大利亞Reichert -Tung公司生產(chǎn)）。

3. 實(shí)驗(yàn)材料與方法：（1）受試對象 精液樣本采集集于 25～40周歲之間男性，無外傷及遺傳性疾病家族史, 無性功能障礙病史, 未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。不明原因性不育患者8例，婚后2年以上未采取任何避孕措施且無生育史，并已排除女方因素。生育力正常男性3例，為身體健康志愿者，婚后1年，已成功自然受孕婦女的丈夫；（2）禁欲3～7d后，在室溫25～30℃的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，由供精者取精。待精液自動液化后，緩慢注入離心管中，以650×g，離心10min，用吸管輕輕吸出精漿，沉淀精子用瓊脂糖進(jìn)行預(yù)包埋，再用戊二醛固定液固定1h后，PBS緩沖液（pH=7.2）洗滌3次（10min/次），鋨酸固定1h，洗滌脫水后，用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，在光鏡下進(jìn)行半薄定位，用甲苯胺藍(lán)染色，超薄切片，鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。

4. 觀察指標(biāo)：在透射電鏡下主要觀察不同形態(tài)精子的質(zhì)膜、頂體、細(xì)胞核、精子頸部、線粒體和微管等病理性改變。

結(jié) 果

通過在電鏡下對不同頭部形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)觀察，我們發(fā)現(xiàn)與正常形態(tài)精子相比，錐形頭、圓頭、長頭、雙頭等異常頭部形態(tài)精子均存在著不同程度的超微結(jié)構(gòu)缺陷。通過對不同頭部形態(tài)精子進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，我們發(fā)現(xiàn)與正常形態(tài)精子相比，錐形頭、圓頭、雙頭等異常頭部形態(tài)精子均存在著不同程度的超微結(jié)構(gòu)缺陷。正常精子頭部長寬比例適當(dāng)，質(zhì)膜和頂體完整，細(xì)胞核無或有少量空泡，線粒體排列有序，微管整齊，9+2結(jié)構(gòu)完整（圖1）；錐形頭精子頭部呈錐形，質(zhì)膜腫脹破損，線粒體嵴不明顯或呈空泡化（圖2）；圓頭精子質(zhì)膜破損，頂體缺失，個別精子細(xì)胞核內(nèi)含有空泡，線粒體排列雜亂，某些線粒體空泡化（圖3）；雙頭精子質(zhì)膜腫脹，細(xì)胞核分化不成熟，內(nèi)含空泡，可觀察到雙頭精子被吞噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象（圖4）。

圖1 正常精子超微結(jié)構(gòu)

圖2 錐形頭精子超微結(jié)構(gòu)

圖3 圓頭精子超微結(jié)構(gòu)

圖4 雙頭精子超微結(jié)構(gòu)

討 論

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無法觀察精子內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，只有分辨率更高的電子顯微鏡才能清晰觀察其各種超微結(jié)構(gòu)，了解其內(nèi)部許多亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化與異常，判斷精子超微結(jié)構(gòu)正常與缺陷程度，從而準(zhǔn)確評價(jià)精子質(zhì)量，進(jìn)一步分析男性不育的成因。研究發(fā)現(xiàn)男性不育與精子質(zhì)膜、頂體、細(xì)胞核、線粒體和微管等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷密切相關(guān)[3]。因此，在精子形態(tài)學(xué)診斷中，我們有必要在電子顯微鏡下去評價(jià)精子質(zhì)量。電鏡是目前精子形態(tài)學(xué)檢測最客觀可信的依據(jù)，臨床上診斷的某些原因不明的不育癥實(shí)際上是有因可查的[4,5]。通過電鏡觀察精子的超微結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)不同頭部形態(tài)精子均存在質(zhì)膜、頂體、細(xì)胞核、線粒體和微管等一種或幾種超微結(jié)構(gòu)缺陷，這與采集樣本常規(guī)精液檢查中精子畸形率偏高相一致。精子超微結(jié)構(gòu)的完整性與精子質(zhì)量密切相關(guān)，任一超微結(jié)構(gòu)的異常均會導(dǎo)致精子質(zhì)量下降，進(jìn)而降低受精率甚至造成男性不育。對精子超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，觀察不同頭部形態(tài)精子的超微結(jié)構(gòu)缺陷，并在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)和男性不育的成因分析，具有重要意義[6]。

1 質(zhì)膜：精子質(zhì)膜與精子的新陳代謝、精子獲能和頂體反應(yīng)密切相關(guān)。一般將精子質(zhì)膜分為兩部分，精子頭部質(zhì)膜參與頂體反應(yīng)，頂體后區(qū)質(zhì)膜則可識別卵子，并與卵子細(xì)胞膜相結(jié)合，參與受精過程。精子質(zhì)膜腫脹、破損、囊泡化（圖2A，圖2B、圖3A、圖4A）等超微結(jié)構(gòu)缺陷會影響精子的信息傳遞和新陳代謝，當(dāng)質(zhì)膜特異性受體和精卵識別位點(diǎn)受損時，使精子獲能和頂體反應(yīng)受限，嚴(yán)重影響受精過程[7]。精子質(zhì)膜的完整性可反映精子的功能狀態(tài)，是造成男性不育的重要病因。

2. 頂體：精子形成過程中，高爾基復(fù)合體產(chǎn)生圓形囊泡，覆蓋在細(xì)胞核表面，隨著細(xì)胞核濃縮變長，囊泡成為扁平狀，并由頭至尾包繞精子核的大半部分，從而形成頂體。頂體是一種特化的溶酶體，含有頂體酶、透明質(zhì)酸酶等多種酶類，在受精過程中可溶解卵細(xì)胞外的透明帶和放射冠，有促進(jìn)精卵融合的作用。高曉勤等[8]研究發(fā)現(xiàn)，頂體結(jié)構(gòu)的完整性與頂體酶的活性有關(guān)。電鏡下觀察到圓頭精子存在頂體缺失的超微結(jié)構(gòu)缺陷（圖3A, 圖3B），導(dǎo)致圓頭精子無法完成受精，進(jìn)而造成男性不育。此外，部分頂體結(jié)構(gòu)缺陷會導(dǎo)致相應(yīng)部分精子質(zhì)膜異常，造成精卵結(jié)合障礙。

3. 細(xì)胞核：細(xì)胞核是父系遺傳物質(zhì)的所在地，對受精卵的發(fā)育非常重要。精子發(fā)生過程中，細(xì)胞核形態(tài)、大小以及染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)生劇烈變化。這一系列事件均與精子核組蛋白移除以及大量精蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞核有關(guān)，通過精蛋白替代組蛋白，使得染色質(zhì)濃縮6倍以上，形成了一個致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。一方面，精子頭部體積縮小,有利于精子在女性生殖道內(nèi)游動并穿透卵母細(xì)胞；同時又抑制了基因的表達(dá),使遺傳物質(zhì)保持穩(wěn)定。

電鏡下可觀察到不同頭部形態(tài)精子細(xì)胞核空泡化（圖2B、圖3A、圖3B、圖4A），可能與組蛋白替代不完善、染色質(zhì)濃縮異常有關(guān)[9]。細(xì)胞核成熟度直接影響著精子受精能力和受精后原核的形成及胚胎著床，由于精子核不成熟引起的流產(chǎn)也時有報(bào)道。此外，在所研究的不明原因性不育患者精液中，亦可見發(fā)育異常的雙頭精子（圖4A）及雙頭精子被吞噬細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象（圖4B），這是異常精子被凋亡機(jī)制清除的一種正常機(jī)制。

4. 線粒體：線粒體的功能是通過氧化磷酸化合成ATP，為精子的運(yùn)動提供能量。電鏡下可觀察到不同頭部形態(tài)精子尾部的線粒體排列雜亂，堆疊在一起，發(fā)生空泡化等超微結(jié)構(gòu)改變（圖2B、圖3B）。當(dāng)精子線粒體結(jié)構(gòu)異常時，將影響線粒體內(nèi)ATP的合成和自身遺傳物質(zhì)復(fù)制的準(zhǔn)確性。同時伴隨著各種能量代謝酶如琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素氧化酶等的改變，導(dǎo)致精子供能不足，活動力減弱，進(jìn)而降低精子的存活率[10]。研究表明缺乏活動力的精子僅有21%可以完成受孕[11]，因此線粒體超微結(jié)構(gòu)異常是造成男性不育的主要原因之一。

5. 微管：微管是一種具有極性的細(xì)胞骨架，廣泛存在于真核細(xì)胞中。精子尾部的微管以9+2的結(jié)構(gòu)存在，通過纖維蛋白的滑動來調(diào)節(jié)精子的運(yùn)動。微管是精子運(yùn)動的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為精子提供動力，使精子順利抵達(dá)受孕處。電鏡可觀察到有些精子的微管存在損傷、9+2結(jié)構(gòu)的缺失等現(xiàn)象（圖2A、圖3B），可造成精子運(yùn)動障礙，這也是男性不育的一個重要原因[12]。

結(jié) 論

引起男性不育的原因多種多樣，包括生精機(jī)能障礙、輸精管道不暢和內(nèi)分泌紊亂等等[13-15]，這些疾病均可不同程度地影響精液質(zhì)量。精子形態(tài)間接反映精子DNA分子組裝及精子發(fā)育過程，進(jìn)而提示精子功能狀態(tài)，包括精子運(yùn)動、頂體反應(yīng)、與透明帶結(jié)合能力等。精子形態(tài)的任何改變都顯示精子畸形率的增高，可間接反映睪丸生精功能的異常。在精原細(xì)胞到成熟精子的整個過程中，精母細(xì)胞凋亡最容易產(chǎn)生精子畸形。精子形態(tài)與精子質(zhì)量密切相關(guān)，為切實(shí)解決男性不育問題，就必須逐漸完善精子形態(tài)學(xué)與精子質(zhì)量的評價(jià)體系。精子形態(tài)對輔助生殖技術(shù)治療具有重要意義，宮腔內(nèi)人工授精、體外授精或卵胞漿內(nèi)單精子注射的成功率與正常形態(tài)精子的百分率緊密相關(guān)。崔險(xiǎn)峰[16]研究結(jié)果表明正常精子形態(tài)＜5%其IVF受精率為20.0%；正常精子形態(tài)≥5%而＜15%其IVF受精率為67.74%；正常精子形態(tài)≥15%的其IVF受精率為84.91%。

目前臨床仍將精液常規(guī)檢查結(jié)果作為判斷生育力強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，這顯然是不完善的。本實(shí)驗(yàn)對不同頭部形態(tài)精子進(jìn)行電鏡觀察，與正常生育男性精子進(jìn)行比較，從超微結(jié)構(gòu)變化探討精子各部分和各細(xì)胞器形態(tài)特征，結(jié)果顯示有些精子超微結(jié)構(gòu)存在多處病變，表明精子超微結(jié)構(gòu)異常系不明原因男性不育原因之一。總之，精子形態(tài)學(xué)分析和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上的精子質(zhì)量評價(jià)在臨床男性不育的診斷和治療中具有重要作用，將兩者有機(jī)結(jié)合起來，有助于提高男性不育的診斷和治愈率。男性生育力低下是復(fù)雜的多因素疾病，需要建立一套完整的男科學(xué)診斷體系，為男性不育的診斷和治療提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)精子超微結(jié)構(gòu)中頂體的受損率和胞質(zhì)殘?bào)w的數(shù)量都高于光鏡下的檢測結(jié)果，這與電鏡分辨率高，能觀察到膜結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器等更細(xì)微的結(jié)構(gòu)有關(guān)。在光鏡下精液常規(guī)檢查中，個別患者從精子的數(shù)量、形態(tài)、畸變率、活力等均未發(fā)現(xiàn)異常，而在電鏡下卻發(fā)現(xiàn)頂體膜結(jié)構(gòu)受損高于正常對照，這也較好地解釋了原因不明不育癥頂體酶活力低下的報(bào)道[17]，其機(jī)理可能是光鏡下所見的“完整頂體”實(shí)際上已有膜的超微結(jié)構(gòu)損傷,引起頂體酶的丟失或提前釋放所致。由于頂體內(nèi)含多種水解酶，這些酶和頂體膜結(jié)構(gòu)之間是否也存在因果關(guān)系，將是課題組未來深入探討的內(nèi)容。

精子/超微結(jié)構(gòu); 不育, 男性

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（2015-02-14收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.012

R 698.2

資助: 河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：H2013201259); 河北省2013留學(xué)回國人員科研活動項(xiàng)目(編號：C2013005002);國家第48批“留學(xué)回國人員科研啟動基金”(編號：702850515001)**

, E-mail: gesq67@163.com△: 共同第一作者