童葉華朱衛(wèi)中

1. 開(kāi)化縣人民醫(yī)院（浙江開(kāi)化 324300）2. 麗水市人民醫(yī)院

胚胎培養(yǎng)液中添加白蛋白對(duì)pH的影響

童葉華1朱衛(wèi)中2*

1. 開(kāi)化縣人民醫(yī)院（浙江開(kāi)化 324300）2. 麗水市人民醫(yī)院

目的 了解胚胎培養(yǎng)液添加白蛋白對(duì)pH的影響。方法 在HTF受精液、CM卵裂液、G1卵裂液和CSC全程培養(yǎng)液中添加不同濃度的白蛋白制劑，在經(jīng)過(guò)5.0% CO2過(guò)夜平衡后用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)其HCO3-濃度和pH。結(jié)果 白蛋白制劑的HCO3-濃度明顯低于培養(yǎng)液；培養(yǎng)液中添加白蛋白會(huì)降低HCO3-濃度和pH，白蛋白濃度與pH呈高度負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；不同品牌培養(yǎng)液的pH，模型存在較明顯差異，HTF和CM的pH明顯低于G1和CSC（P＜0.01）。結(jié)論 胚胎培養(yǎng)液中添加白蛋白會(huì)降低pH且與培養(yǎng)液的品牌相關(guān)，應(yīng)通過(guò)實(shí)測(cè)胚胎培養(yǎng)液的pH來(lái)確定CO2濃度，尤其是搭配使用不同品牌產(chǎn)品的時(shí)候，僅僅依靠經(jīng)驗(yàn)或廠家提供的參數(shù)是不可靠的。

培養(yǎng)基; 白蛋白類; 氫離子濃度; 二氧化碳

維持培養(yǎng)體系適宜而穩(wěn)定的酸堿度，是影響體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結(jié)局的關(guān)鍵因素之一；胚胎培養(yǎng)液通常采用碳酸氫鹽/碳酸緩沖體系，在一定濃度CO2氣體的支持下，CO2與水反應(yīng)生成碳酸，碳酸與培養(yǎng)液中的碳酸氫鹽組成HCO3-/H2CO3的共軛酸堿緩沖體系以維持合適的pH[1]。當(dāng)培養(yǎng)液的HCO3-或H2CO3濃度發(fā)生變化，其比值會(huì)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值發(fā)生改變。

白蛋白制劑是胚胎實(shí)驗(yàn)室最常用的試劑，是胚胎培養(yǎng)液和移植液的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一；白蛋白具有防止配子和胚胎粘附、中和毒素和穩(wěn)定膠體滲透壓的作用，使用體積濃度為5%～20%[2,3]。胚胎培養(yǎng)液在添加了不同濃度的白蛋白后，其HCO3-濃度受到稀釋，在恒定CO2濃度氣體支持下的pH也會(huì)發(fā)生改變。長(zhǎng)期以來(lái)由于缺少相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，人們?cè)谂咛ヅ囵B(yǎng)液、移植液中添加白蛋白通常憑借自身經(jīng)驗(yàn)或個(gè)人喜好，具有一定的盲目性。為了解添加了不同種類和不同濃度的白蛋白對(duì)不同品牌胚胎培養(yǎng)液pH的影響，我們進(jìn)行了相關(guān)的研究與分析。

材料與方法

一、胚胎培養(yǎng)液與白蛋白制劑

1. In VitroCare HTF受精液（以下簡(jiǎn)稱HTF），批號(hào)I15M104L。

2. Quinn,s Cleverage Medium卵裂液（以下簡(jiǎn)稱CM），批號(hào)E112B。

3. Vtrolife G1卵裂液（以下簡(jiǎn)稱G1），批號(hào)504468。

4. IrvineScientifc Contimous Single Cultuer全程培養(yǎng)液（以下簡(jiǎn)稱CSC），批號(hào)90164010604。

5. Quinn,s HSA人血白蛋白（以下簡(jiǎn)稱HSA），白蛋白濃度：5.0%，批號(hào)GHSA13009E。

6. IrvineScientific SSS合成血清蛋白（以下簡(jiǎn)稱SSS），白蛋白濃度：5.0%，批號(hào)99193140101。

二、儀器設(shè)備

1. 美國(guó)Forma 3121型二氧化碳培養(yǎng)箱。

2. 日本K-1 System胚胎操作箱，以5.0% CO2氣體支持。

3. 德國(guó)IN CONTROL 1050 二氧化碳測(cè)定儀。

4. 丹麥雷度ABL 80 FLEX型血?dú)夥治鰞x。

5. 天津斯格瑞SMC 30C滲透壓測(cè)定儀。

三、檢測(cè)方法

1. 取8組14mL 的BD試管各5支，編號(hào)，在1～2組、3～4組、5～6組、7～8組試管中分別加入HTF、CM、G1、CSC胚胎培養(yǎng)液5.0mL、4.75mL、 4.50mL、4.25mL和4.00mL，然后在1、3、5、7組的各5支試管中分別加入5.0%HSA 0ml、0.25ml、0.5mL、0.75mL、1.0mL，在2、4、6、8組的各5支試管中分別加入5.0%SSS 0mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1.0mL，混勻。各組胚胎培養(yǎng)液添加的白蛋白體積濃度（V/V）分別為0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%。

2. 將各組試管松蓋，放入37.0℃、5.0% CO2培養(yǎng)箱，過(guò)夜平衡（氣體平衡時(shí)間18h）。CO2培養(yǎng)箱用二氧化碳測(cè)定儀進(jìn)行日常檢測(cè)。

3. 將平衡后的試管分組從培養(yǎng)箱中取出，在胚胎操作箱中用1mL BD注射器吸取胚胎培養(yǎng)液，排除空氣，封密，立即送檢驗(yàn)科進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

4. 血?dú)夥治鰞x完成校準(zhǔn)和日常室內(nèi)質(zhì)控，對(duì)各胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行血?dú)夥治?，重?fù)二次結(jié)果，取均值。

5. 滲透壓測(cè)定儀完成校準(zhǔn)和日常室內(nèi)質(zhì)控，檢測(cè)各胚胎培養(yǎng)液及白蛋白制劑的滲透壓，重復(fù)二次結(jié)果，取均值。

四、結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行相關(guān)性分析。

結(jié) 果

1. 各種胚胎培養(yǎng)液均為等滲液體，電解質(zhì)及HCO3-濃度略有差異，與人體血清參考值比較接近；胚胎培養(yǎng)液在5.0% CO2氣體平衡后的pH在7.325～7.420之間。白蛋白制劑HAS、SSS均為等滲液體，但HCO3-濃度明顯低于培養(yǎng)液，故在5.0% CO2氣體平衡后的pH低于6.80。各種胚胎培養(yǎng)液及白蛋白制劑經(jīng)過(guò)5.0% CO2平衡后的血?dú)夥治黾皾B透壓測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各種胚胎培養(yǎng)液及白蛋白制劑經(jīng)過(guò)5.0% CO2平衡后的血?dú)夥治黾皾B透壓測(cè)定結(jié)果

2. 各種胚胎培養(yǎng)液隨著白蛋白濃度的提高，HCO3-濃度逐漸降低，其pH值均呈降低趨勢(shì)，pH值與培養(yǎng)液添加的白蛋白濃度呈高度負(fù)相關(guān)關(guān)系（r =-0.972～-0.994，P＜0.01）。HTF、CM的pH值比G1、CSC整體減低，其差值隨著白蛋白濃度的增高而降低，添加體積濃度10%白蛋白的HTF和CM的pH值比G1和CSC明顯減低（P＜0.01），差值在0.05以上。添加HSA與添加SSS的培養(yǎng)液的pH值無(wú)顯著性差異（P＞0.01）。胚胎培養(yǎng)液HTF、CM、G1、CSC添加不同濃度白蛋白制劑HSA、SSS的pH變化見(jiàn)表2。

表2 胚胎培養(yǎng)液HTF、CM、G1、CSC添加不同濃度白蛋白制劑HSA、SSS的pH變化

討 論

胚胎實(shí)驗(yàn)室所用的白蛋白制劑主要有人血清白蛋白、重組白蛋白和大分子混合物，IrvineScientific合成血清蛋白SSS屬于后者，是84%人血清白蛋白與16%α球蛋白、β球蛋白的混合物[3]。白蛋白制劑為等滲液體，加入胚胎培養(yǎng)液后不會(huì)改變液體總的滲透壓，但會(huì)改變各成份的構(gòu)成比例，其中就包括HCO3-濃度。

由于胚胎培養(yǎng)液中含有與血漿相當(dāng)濃度的HCO3-，而白蛋白制劑中的HCO3-濃度很低，若將5%～20%的白蛋白添加到胚胎培養(yǎng)液中則相應(yīng)降低了5%～20%的HCO3-濃度。本文結(jié)果顯示在相同的胚胎培養(yǎng)中加入體積濃度20%的白蛋白比加入體積濃度10%的白蛋白在CO2平衡后的pH要低0.05以上，相當(dāng)于將CO2濃度從5.0%提高至6.0%產(chǎn)生的降低pH的平衡效果[1]。

近年來(lái)，胚胎培養(yǎng)最佳pH為多少的問(wèn)題引起了人們的高度關(guān)注。有人證實(shí)pH降至7.20以下受精率將減低[4]，還有人提出卵裂期胚胎較適宜的pH在7.00～7.30范圍內(nèi)[5]；Patrizio[6]確定受精、卵裂和囊胚培養(yǎng)的pH標(biāo)準(zhǔn)分別為7.30、7.20和7.30。目前一般認(rèn)為受精、卵裂和囊胚培養(yǎng)的最適pH為7.20～7.30。

胚胎培養(yǎng)液HTF、CM、G1和CSC在5.0% CO2過(guò)夜平衡后的pH分別為 7.325、7.355、7.420和7.405，在添加體積濃度10%的白蛋白制劑后其pH均出現(xiàn)下降，其中HTF和CM的pH在7.260～7.285之間，而G1和CSC的pH在7.315～7.345之間，HTF和CM的pH要比G1和CSC的pH低0.05～0.06，表明HTF和CM需要的CO2濃度應(yīng)低于G1和CSC。本文認(rèn)為HTF和CM在添加體積濃度10%的白蛋白后過(guò)夜平衡的CO2濃度以（5.0～5.5）%為宜，而G1和CSC則需要5.5～6.0%的CO2濃度。

綜上所述，胚胎培養(yǎng)液在添加不同濃度的白蛋白后會(huì)改變pH，應(yīng)通過(guò)實(shí)測(cè)pH來(lái)確定酸堿度和CO2濃度是否合適，尤其是搭配使用不同品牌產(chǎn)品的時(shí)候，若僅僅依靠經(jīng)驗(yàn)或廠家提供的參數(shù)是不可靠的。采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)CO2平衡后的胚胎培養(yǎng)液，具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，除pH外還可以同時(shí)得到HCO3-、電解質(zhì)、葡萄糖及乳酸等具有參考價(jià)值的分析指標(biāo)。

1 朱衛(wèi)中, 胡京美, 葉明建. 影響胚胎培養(yǎng)液PH及二氧化碳平衡的因素探討. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 2011; 20(3): 223-227

2 陳子江主編. 人類生殖與輔助生殖. 第1版. 北京: 科學(xué)出版社, 2005: 421-423

3 黃國(guó)寧, 孫海翔主編. 體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室技術(shù).第1版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2012: 201-203

4 Miyamoto H, Toyoda Y, Chang MC. Effect of hydrogenion concentration on in vitro fertilization of mouse,golden hanmster and rat eggs. Biol Reprod 1974; 10(4): 487-493

5 Phillips KP, Leveille MC, Claman P, et al. Intracellular pH regulation in human preimplantation embryos. Hum Reprod 2000; 15(4): 896-904

6 Patrizio P, Tucker MJ, Guelman V. 人類輔助生殖彩色圖譜:實(shí)驗(yàn)室與臨床觀念. 第1版. 天津: 天津科技翻譯出版公司, 2005; 201-203

（2015-01-01收稿）

The effect of albumin on the pH value of embryo culture medium

Tong Yehua1, Zhu Weizhong2*
1. The People,s Hospital of Kaihua, Kaihua 324300,Zhejiang, China 2. The People,s Hospital of Lishui Corresponding author: Zhu Weizhong, E-mail: 7087807@163.com

Objective To explore the effect of albumin on the pH value of embryo culture medium. Methods Firstly, albumin with different concentrations were added into HTF, CM, G1 and CSC culture medium. Then these cultures were incubated in incubator with CO2of 5.0% overnight. Lastly, the concentration of HCO3-and pH value were detected using blood-gas analyzer. Results The concentration of HCO3-of albumin was signifcantly lower than that of cultures. Adding albumin into these cultures can reduce the concentration of HCO3-and pH value, and the concentration of albumin was highly negatively correlated with pH value (P＜0.01). The pH value of different culture was different, and the pH value of HTF and CM was signifcantly lower than that of G1 and CSC (P＜0.01). Conclusion Adding albumin into culture medium can reduce it's pH value, which may be related to different products of culture medium.It's not reliable to determine the concentration of CO2only based on experience or parameters provided by manufacturers, especially when using different culture product together. We should actually detect pH value of the cultures.

culture media; albumins; Hydrogen-Ion Concentration; Carbon Dioxide

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.006

R 321-33

*通訊作者, E-mail: 7087807@163.com