吳霞

摘 要：以采自白酒廠的酒糟等為原材料，經(jīng)過分離純化等一系列過程得到的酵母菌株作為出發(fā)菌種。通過紫外線誘變處理，并采用pH=3的選擇培養(yǎng)基作為篩選條件，得出紫外照射90～120s為最佳條件，能篩選出適合白酒廠生產(chǎn)工藝條件要求的酒用耐酸酵母菌株。

關(guān)鍵詞：白酒生產(chǎn)；酵母菌；誘變育種；耐酸酵母菌

中圖分類號(hào)：TB

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：16723198（2015）19020602

0 引言

酵母菌是酒類生產(chǎn)中一種重要真菌類微生物，在自然環(huán)境中，多分存在于含糖量高、偏酸性條件下。25-30℃的溫度為其最適合的生長(zhǎng)的溫度，最適合的pH值是5-6，發(fā)酵溫度一般為30-34℃。在傳統(tǒng)的白酒生產(chǎn)中，在窖池內(nèi)的發(fā)酵時(shí)間一般要2-3個(gè)月。一般酒精會(huì)在酵母菌在發(fā)酵的前1-2個(gè)月產(chǎn)生，發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，伴隨著有機(jī)酸的不斷積累pH逐漸降低，酵母的生長(zhǎng)繁殖會(huì)受到抑制，發(fā)酵作用不斷減弱，直至停止，這樣原料就不能充分的利用造成原料浪費(fèi)?？梢娺x擇一種耐酸性高的酵母菌有利于促進(jìn)原料的充分利用，降低生產(chǎn)的成本，提高白酒的產(chǎn)量，帶來更大的經(jīng)濟(jì)效益。

近年來，隨著科技發(fā)展，許多新的誘變劑被研發(fā)應(yīng)用于誘變育種，但紫外線作為誘變因子進(jìn)行誘變育種已經(jīng)有一段歷史了，誘變育種仍有很大的成功率，具有方便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。

紫外燈所發(fā)射的紫外線波長(zhǎng)大約有80%為2537埃，在誘變育種的有效波長(zhǎng)范圍內(nèi)。紫外線主要是通過改變DHA來引起生物效應(yīng)的。DNA對(duì)紫外線的吸收作用非常強(qiáng)烈，特別是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感，紫外線可以通過很多形式引起DHA的改變，如DNA鏈的斷裂，DNA分子鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交鏈，核酸和蛋白質(zhì)的交鏈，胞嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚體的形成。可見光能夠?qū)ψ贤饩€損傷DNA遺傳活性的作用進(jìn)行復(fù)活。所以進(jìn)過誘變后的微生物要被可見光或者是長(zhǎng)波紫外線的照射，故誘變處理后的樣品要用黑紙包裹，且樣品不能存放太久，以免突變?cè)诤诎抵薪?jīng)其它機(jī)制得到修復(fù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和設(shè)備

DG-1多功能恒溫箱（上海醫(yī)療器械廠）；PHS-3C酸度計(jì)（上海虹益儀器廠）；GB4027手提式壓力蒸汽滅菌鍋（上海柳港醫(yī)用器械廠）；XS-18雙目顯微鏡（江南醫(yī)療器械廠）；H2Q-R振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子公司）；HH-SY21-NI4電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；特種凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。

1.2 材料和試劑

95%乙醇（重慶化學(xué)試劑總廠）；麥芽粉（四川射洪制藥廠）；瓊脂粉（上?；瘜W(xué)試劑總廠）；碘（上?；瘜W(xué)試劑三廠）；鹽酸（重慶化學(xué)試劑總廠）；酒糟、大曲、窖泥、黃漿水（四川邛崍古川酒廠）。

1.3 培養(yǎng)基制備

麥芽粉按20%（m/v）比例加溫水配制，55-60℃的恒溫水浴鍋中糖化5h，過濾后，加入2%（m/v）的瓊脂粉攪勻后滅菌30min。在0.1MPa，120℃滅菌30min，冷卻后自然pH入冰箱保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)思路

利用從古川酒廠窖池里采集的相關(guān)材料，依據(jù)相關(guān)的生物化學(xué)和微生物學(xué)原理、理化技術(shù)方法，通過分離純化得到可作為出發(fā)種的酵母菌，再經(jīng)過紫外線進(jìn)行誘變育種，就可以選育那些能夠在低pH值下依然能夠進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育并且發(fā)酵能力的比較好的耐酸酵母菌作為酒用酵母菌了。

1.4.1 菌種分離純化

（1）固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

分別取酒糟、大曲、窖泥，黃漿水1.5g，加入無菌生理鹽水制成菌懸液，移取酒糟、大曲、窖泥，黃漿水制成的菌懸液各1mL，用無菌生理鹽水按10倍稀釋6次，分別移取稀釋液1mL到各平板中，迅速用涂布器涂抹均勻后，培養(yǎng)皿封蓋，待稀釋的培養(yǎng)液滲入麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基后，倒置在恒溫箱中以28℃下培養(yǎng)2天。按此方法轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次，直至得到純種菌株后，斜面菌種保藏。每個(gè)樣品制備6個(gè)平行平板。

（2）鏡檢確定出發(fā)菌種。

結(jié)合鏡檢，選擇顏色為乳白色，表面光滑有光澤，長(zhǎng)勢(shì)豐滿且無雜菌斑的單菌落，經(jīng)鏡檢進(jìn)一步確定是酵母菌，將其作為下一步誘變育種的出發(fā)菌種。

1.4.2 誘變育種

誘變選育的過程：

誘變選種的過程是比較繁雜的過程，首先要選出發(fā)種然后制備菌懸液，利用紫外線照射處理，作穩(wěn)定性能培養(yǎng)，進(jìn)行稀釋涂菌分離、鏡檢挑菌、初篩、斜面?zhèn)鞔?，再?jīng)過復(fù)篩，最后才能得到目的菌株。

（1）制備菌懸液。

選取鑒定純種的出發(fā)菌種，通過生理鹽水洗滌斜面，按無菌操作法制備菌懸液，盛入三角瓶中。三角瓶置于振蕩器180r/min，以使菌體全部以單細(xì)胞狀態(tài)分散開來。再將菌液用以滅菌的漏斗濾紙過濾，得到較清澈的菌懸液。以血球計(jì)數(shù)板的方法來計(jì)算菌懸液的菌體濃度，用生理鹽水稀釋成濃度約為1×106個(gè)/mL。

（2）紫外誘變。

無菌操作臺(tái)上，用無菌移液管分別移取8份5mL的菌液至8個(gè)7cm口徑無菌平皿中，編號(hào)為1-8號(hào)，平皿置于紫外燈30cm處。關(guān)閉其余照明，使實(shí)驗(yàn)條件為暗室，同時(shí)打開紅燈。

其中1號(hào)平皿作為對(duì)照，即照射時(shí)間為0s；2號(hào)平皿置于磁力攪拌器，使菌體一直保持懸浮。打開紫外燈2min后波長(zhǎng)趨于穩(wěn)定后，移開平皿的蓋子開始計(jì)時(shí)。第30s時(shí)蓋上平皿的蓋子，并關(guān)掉紫外燈和攪拌器，將2號(hào)平皿用黑色紙覆蓋。按同樣的操作，將3號(hào)按60s、4號(hào)按90s、5號(hào)按120s、6號(hào)按150s、7號(hào)按180s、8號(hào)按240s的照射時(shí)間進(jìn)行處理。

（3）誘變菌株的穩(wěn)定性能培養(yǎng)。

用移液管分別移取1-8號(hào)菌液各1mL，分別用生理鹽水按10倍稀釋4次，按無菌操作接入麥芽汁固體培養(yǎng)基上，用黑色牛皮紙包好培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)2天。每個(gè)樣品做3組平行。

根據(jù)3組1-8號(hào)平板長(zhǎng)出的單菌落平均數(shù)，可以算出1-8號(hào)的菌液的濃度。1號(hào)值作為原始菌液的活菌數(shù)，2-8號(hào)值分別代表不同時(shí)間照射后菌液的活菌數(shù)，這樣即可算出照射后菌液的菌體的存活和死亡的比例。

根據(jù)各照射劑量的死亡率，如果照射劑量太小，變異菌體的占有率非常低，反之，菌體的存活比例也會(huì)比較低，都不宜于菌體的挑選。我們一般要求照射死亡在80%-90%之間。因此最后確定4號(hào)和5號(hào)菌液為最佳。

（4）酸式麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基的制備。

用稀鹽酸調(diào)加熱溶解后的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基為pH=3。用酸式麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基倒平板，共制備10個(gè)。

（5）耐酸菌株篩選。

將（3）中得到的作穩(wěn)定性狀培養(yǎng)的4號(hào)5號(hào)誘變后的菌液的培養(yǎng)液，用生理鹽水按10倍稀釋6次后用移液管各取1mL，將其接種到pH=3的酸式麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基上，倒置28℃下培養(yǎng)2天。每個(gè)樣品做3組平行。重復(fù)轉(zhuǎn)接4次，得到目的篩選菌株。

2 結(jié)果與討論

在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間，酵母菌所處的生長(zhǎng)環(huán)境的會(huì)慢慢變低，最后會(huì)達(dá)到一個(gè)很低的水平，比如黃漿水，最后的pH值就降低到了3。酵母菌低是很難在這種pH值的環(huán)境下生存的。由此可見在發(fā)酵過程中會(huì)有大量的有機(jī)酸不斷地積累，到整個(gè)過程的后期由于有機(jī)酸的積累酸度處于一個(gè)較高的程度這就抑制了發(fā)酵。酵母菌隨pH值的降低，其單菌落的直徑值和厚度值不斷變小，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖就會(huì)受到抑制，可見pH值的變化嚴(yán)重的影響著酵母菌的生長(zhǎng)繁殖。故篩選一種耐酸酵母菌，在生產(chǎn)上具有重要意義。

采用紫外線誘變方式可改變普通酵母菌株的相關(guān)性能，實(shí)驗(yàn)表明4號(hào)和5號(hào)菌液的紫外線照射劑量（即90s和120s）為最佳。誘變時(shí)間開始逐漸增加對(duì)生長(zhǎng)有利，當(dāng)超過120s后，其生長(zhǎng)又受到抑制，故紫外誘變最佳條件為90～120s。

3 結(jié)論

通過紫外線誘變方法，有效地篩選到了所需要的耐酸性能較好的酵母菌種，誘變條件為紫外燈照射90～120s，這對(duì)白酒的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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