馬 萍 紀 中 戚漢平 曹永剛 黃 偉

（哈爾濱醫(yī)科大學，黑龍江 大慶 163319）

心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為繼腫瘤之后威脅全人類健康的第二大疾患。其中因冠心病死亡的占其死亡總數(shù)的50%左右，且呈上升趨勢，心肌梗死是冠心病中常見的嚴重類型。臨床上尋找新的更有效、更安全、更經(jīng)濟的防治方法仍是研究的熱點問題。黃芩苷具有抗氧化、抗炎、保護缺血后受損心肌細胞的作用，臨床上已經(jīng)廣泛運用于各種心血管疾病的治療。本課題旨在研究黃芩苷預處理對大鼠心肌的保護作用及其調(diào)控機制，為黃芩苷的開發(fā)研制及心肌梗死（AMI）的防治提供理論依據(jù)。

材料

1．藥品及試劑：黃芩苷（嘉迪歐公司提供，批號：GDL20120224A），Bax及Bcl－2小鼠抗大鼠單克隆抗體（購于Abcam），GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體（購于Santa Cruz），RNA試劑盒、熒光定量PCR試劑盒及引物設(shè)計（均為TaKaRa產(chǎn)品）。

2．動物與分組：30只健康Wistar大鼠（由哈爾濱醫(yī)科大學動物中心提供），體重210～230g，隨機分為三組，每組10只。假手術(shù)組（Sham）、心肌梗死模型組（簡稱心梗模型組）（MI）、黃芩苷組（BAI）。各組依次連續(xù)4周分別灌胃給藥生理鹽水、BAI 400mg/kg·d，末次給藥30min后建立大鼠急性心肌梗死模型。

方法

1．心肌梗死模型的制備：Wistar大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉，頸部至劍突去毛，分離氣管，連接麻醉呼吸機，開胸后進行輔助呼吸。呼吸頻率16～18次/min，吸氣/呼氣比為1∶2，潮氣量350～550mL。連接心電圖導聯(lián)，分別為右上肢、左下肢、腹部（肢體Ⅱ?qū)?lián)），在大鼠胸骨左緣第3、4肋間開胸暴露心臟，輕壓擠出心臟，5/0號細線結(jié)扎冠狀動脈左前降支起始端，迅速將心臟放回胸腔，排出空氣，閉胸[1]。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

2．Western blotting檢測 Bax及 Bcl－2蛋白水平，提取心肌總蛋白，BCA－100法測定蛋白含量。取100μg等量蛋白經(jīng)10%SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉1h后分別與小鼠抗大鼠Bax、Bcl－2及兔抗大鼠GAPDH抗體（以TBS稀釋，濃度分別為1∶500、1∶200）室溫孵育2h；洗膜后與二抗（兔抗小鼠及山羊抗兔IgG）室溫孵育1h，化學發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、掃描分析。以目的條帶和GAPDH條帶吸光度比值作為半定量結(jié)果。

3．熒光定量PCR半定量檢測心肌肌鈣蛋白（cTn－T）mRNA表達：提取心肌總RNA，計算RNA的純度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（TaKaRa），合成的cDNA儲存在－20℃條件下備用。以β－actin為內(nèi)參照，引物如下：cTn－T上游5’－ACC TAT GCC GGC AGC TTC A－3’，下游5’－GAG AGT GGG CCG CTT AAA CTT G－3’，β－actin 上 游 5’－GCG AGA AGA TGA CCC AGA TC－3’，下 游 5’－CCA GTG GTA CGG CCA GAG G－3’。合成cDNA。定量PCR檢測為20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)液中包括 SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，PCR forward primer及PCR reverse primer各0．4μL，Rox Referance Dye 0．4μL，ddH2O 6．8μL，模 板cDNA 2μL。cTn－T及β－actin的PCR反應(yīng)條件為95℃30s，1個循環(huán)，95℃10s、62℃31s45個循環(huán)。

4．標準曲線的制備，將PCR產(chǎn)物按照1/5倍濃度梯度進行稀釋，選擇10 000、2000、400、80、16、3．2濃度的稀釋產(chǎn)物作為標準模板，進行熒光定量PCR反應(yīng)。通過這6個標準品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，繪制標準曲線[2]。

結(jié)果

1．Western blotting檢測 Bax及 Bcl－2蛋白水平，心梗模型組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；黃芩組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達低于心梗模型組（P＜0．05）；心梗模型組大鼠心肌細胞Bcl－2蛋白表達低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；黃芩苷組大鼠心肌細胞Bcl－2蛋白表達高于心梗模型組（P＜0．05）。見表1。

表1 黃芩苷對心肌梗死大鼠心肌細胞Bax及Bcl－2蛋白表達的影響（±s）

表1 黃芩苷對心肌梗死大鼠心肌細胞Bax及Bcl－2蛋白表達的影響（±s）

注：＊與心梗模型組比較，＊P＜0．05

分組 例數(shù) Bax/GAPDH Bcl－2/GAPDH假手術(shù)組 10 0．6±0．082＊ 1．8±0．095＊心梗模型組 10 1．5±0．079 0．9±0．086黃芩苷組 10 0．8±0．094＊ 1．3±0．072＊

2．繪制標準曲線：以不同定量模板起始濃度的對數(shù)（lgC）為橫坐標，以CT值為縱坐標，得到標準曲線，相關(guān)系數(shù)R2＝0．9968，符合要求。

3．實時熒光定量PCR測定結(jié)果：根據(jù)不同組中cTn－T的CT值，從標準曲線上計算出每組樣品的濃度，進而計算出目標基因和內(nèi)參基因濃度的比值。心梗模型組大鼠心肌細胞cTn－T mRNA表達明顯低于假手術(shù)組（P＜0．01），黃芩苷組大鼠心肌細胞cTn－T mRNA表達高于心梗模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。

表2 黃芩苷對心肌梗死大鼠心肌細胞cTn－T mRNA表達的影響（±s）

表2 黃芩苷對心肌梗死大鼠心肌細胞cTn－T mRNA表達的影響（±s）

注：與心梗模型組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

分組 例數(shù) cTn－T/β－actin mRNA假手術(shù)組 10 2．43±0．95＊＊心梗模型組 10 0．63±0．26黃芩苷組 10 1．78±0．89＊

討論

急性心肌梗死（AMI）是嚴重威脅人類生命的主要疾病之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，缺血、缺氧以及缺血再灌注過程中心肌細胞除發(fā)生壞死外，還可誘發(fā)和（或）啟動心肌細胞凋亡。細胞凋亡受基因的調(diào)控，表現(xiàn)為凋亡信號通路的啟動和相關(guān)基因的表達。在不同的因素刺激下，參與誘導心肌細胞凋亡的調(diào)控基因不盡相同。介導細胞凋亡的信號傳導通路有多條，且它們之間存在相互聯(lián)系。凋亡信號的刺激，一方面通過細胞內(nèi)酶促級聯(lián)反應(yīng)，活化特異性核酸內(nèi)切酶和轉(zhuǎn)錄因子，引起細胞發(fā)生凋亡的形態(tài)與生化改變；另一方面活化凋亡調(diào)控基因表達。

Bax是Bcl－2的同源體，可抑制Bcl－2的作用，促進細胞凋亡。本研究顯示AMI后，心梗模型組大鼠心肌組織的Bax基因蛋白表達高于假手術(shù)組（P＜0．05）。Bax表達促進細胞凋亡可能通過以下幾種機制實現(xiàn)：①Bax與Bcl－2形成異源二聚體，抑制Bcl－2作用，還可能抑制Bcl－2家族中如Bcl－xL等其他抑制凋亡基因的作用；②Bax/Bax同源二聚體的形成，抑制線粒體細胞色素C釋放，促進細胞凋亡；③Bax本身具有促進細胞凋亡的作用。

Bcl－2家族是公認的凋亡抑制基因，可抑制多種因素如氧自由基和p53誘導的細胞凋亡，也可以減少缺血再灌注心肌細胞的凋亡。本實驗結(jié)果顯示，AMI后心肌組織的Bcl－2蛋白低于假手術(shù)組水平（P＜0．05）。提示Bcl－2對心肌細胞具有保護作用，誘導心肌細胞表達Bcl－2已成為探索心肌保護措施的新途徑。

cTn－T存在于心肌細胞的細肌絲中，是心肌肌鈣蛋白復合體中的一種多肽亞單位，分子量為37KD，cTn－T作為心肌細胞所特有的一種調(diào)鈣蛋白，完全具有心肌組織特異性并具有高度敏感性，因此是評價心肌壞死的首選標志物[3]。本實驗結(jié)果顯示AMI后心梗模型組大鼠心肌細胞cTn－T mRNA表達明顯低于假手術(shù)組（P＜0．01），提示心肌組織壞死。

黃芩苷屬黃酮類，是從中藥黃芩中提取的主要成分，黃芩苷的藥理作用體現(xiàn)在很多方面，主要是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、阻止鈣離子通道、抑制醛糖還原酶、抗病毒、抗過敏等，并對免疫、心腦血管、消化、神經(jīng)等系統(tǒng)具有保護作用。近年關(guān)于黃芩苷在心、腦血管系統(tǒng)作用的實驗研究日益增多，Peng及其同事近期研究證實：口服黃芩苷能通過抗氧化機制有效保護心臟缺血性損傷。在一項體外研究中，黃芩苷預處理可通過抗炎機制減輕培養(yǎng)的大鼠心肌細胞凋亡[4]。在我們研究中在體預防給藥后發(fā)現(xiàn)，黃芩苷組與心梗模型組相比，Bax蛋白表達降低（P＜0．05）、Bcl－2蛋白表達升高（P＜0．05）、cTn－T mRNA表達升高（P＜0．05）。提示黃芩苷可能通過上調(diào)cTn－T mRNA 表達，上調(diào)Bcl－2蛋白、下調(diào)Bax蛋白表達，從而抑制心梗后心肌細胞凋亡的發(fā)生，這應(yīng)是其保護心肌細胞，防治心肌梗死的作用機制之一。

[1]李貽奎，趙樂，何萍，等 ．提高結(jié)扎冠狀動脈在體大鼠心肌梗死模型制作速度和質(zhì)量的研究[J]．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（7）：948－950．

[2]馬萍，紀中，紀長偉，等 ．藍莓花色苷預處理對心肌梗死大鼠的保護作用[J]．中國比較醫(yī)學雜志，2013，23（6）：49－52．

[3]曾紅蓮，李露明，班正賀 ．心肌肌鈣蛋白T檢測對急性心肌梗死的診斷價值[J]．當代醫(yī)學，2011，17（1）：29－30．

[4]Lin L，Wu XD，Davey AK，et a1．The anti－inflammatory effect of baicalin on hypoxia/reoxygenation and TNF－alpha induced injury in cultural rat cardiomyopathy[J]．Phytother Res，2010，24（3）：429－437 ．