陳利娟 吳斌 何冰芳

生物表面活性劑是一種由微生物合成的、結(jié)構(gòu)多樣的表面活性物質(zhì)，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂及中性類脂衍生物等［1］。目前，研究最廣泛的生物表面活性劑是糖脂，其中對由銅綠假單胞菌產(chǎn)的鼠李糖脂研究最多［2］。鼠李糖脂具有乳化、增溶及降低界面張力等功能，在生物能源、石油化工、生物醫(yī)藥及食品等領(lǐng)域有較大應(yīng)用前景［3-7］。目前較低的產(chǎn)量和過高的生產(chǎn)成本限制了鼠李糖脂在工業(yè)上廣泛應(yīng)用，因此獲得一株高產(chǎn)菌株，對于鼠李糖脂工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。常壓室溫等離子體誘變是一種新型的育種技術(shù)，該技術(shù)可以快速高效地突變各類微生物，已成為獲取高產(chǎn)菌株的有效方法［8］。

本研究對本實驗室篩選并保存的產(chǎn)鼠李糖脂菌株P(guān)seudomonas aeruginosa C3進行常壓室溫等離子體誘變，篩選出一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，并通過單因素實驗進一步對產(chǎn)脂培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，最后研究產(chǎn)物鼠李糖脂對枯草芽孢桿菌細胞壁的影響，旨在選育鼠李糖脂高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試劑 菌種銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa C3），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CL）由本實驗室分離篩選獲得；酵母粉、蛋白胨購自英國Oxoid公司，苔黑酚購自美國 Aladdin公司，其他試劑均為化學(xué)純采購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基：藍色凝膠瓊脂平板（％）［9］：葡 萄 糖 2，KH2PO40.07，Na2HPO40.09，NaNO30.2，MgSO4·7H2O 0.04，CaCl2·2H2O 0.01，CTAB 0.02，亞甲基藍 0.000 5，瓊脂 1.5，2mL/L 微量元素溶液。微量元素溶液（％）：FeSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.15。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（％）：甘油 1，NaNO30.5，KH2PO40.1，Na2HPO4·12H2O 0.1，MgSO40.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，CaCl2·2H2O 0.01，pH6.0。產(chǎn)酶培養(yǎng)基（％）：乳糖 1，K2HPO40.3，MgSO4·7H2O 0.03，蛋白胨1.5，玉米漿粉1.5，初始 pH 值 5.0-5. 5。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂含量檢測方法 采用苔黑酚法測定鼠李糖脂含量［10］。鼠李糖脂的鼠李糖基在濃硫酸作用下脫水形成糠醛類化合物，與地衣酚結(jié)合顯示藍綠色，在421nm有最大吸收。根據(jù)鼠李糖標準曲線得到鼠李糖的濃度，鼠李糖脂的濃度為鼠李糖的3.4 倍［11］。

1.2.2 ARTP誘變方法 按照ARTP生物誘變育種機的操作流程。以氦氣為氣體，通氣流量為10 L/min，作用距離2 mm，作用功率120 W［12］。將培養(yǎng)好銅綠假單胞菌C3的種子用0.9％的生理鹽水稀至OD660=0.6，取10μL菌液均勻涂布于無菌小鐵片上，風干后放入育種機中進行誘變。為了尋找最佳誘變條件，設(shè)定處理時間（30、60、90和120s），將處理后的樣品稀釋涂布平板，通過平板菌落計數(shù)以未處理樣品為對照計算致死率。

1.2.3 突變株篩選方法 采用藍色凝膠平板篩選法進行初篩。平板中的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、亞甲基藍與陰離子表面活性劑鼠李糖脂發(fā)生絡(luò)合作用，便形成藍色光暈，通過測定藍色暈圈直徑與菌落直徑之比，以此比值來初步衡量鼠李糖脂產(chǎn)量的高低。復(fù)篩：將初篩單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，180r/min培養(yǎng)12h得到種子液，按6％接種量接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，200r/min培養(yǎng)5d，培養(yǎng)液離心后取上清測定鼠李糖脂含量。

1.2.4 突變株SC-11發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)優(yōu)化 采用發(fā)酵培養(yǎng)基，以濃度為1％的葡萄糖、豆油、甘油、玉米粉、蔗糖、乳糖、菜籽油和柴油為碳源，探討不同碳源對突變株SC-11生長及產(chǎn)鼠李糖脂的影響，進而研究碳源濃度對發(fā)酵的影響。在培養(yǎng)基碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨、尿素和硫酸銨為無機氮源（初始添加量為5g/L），以酵母粉、牛肉膏、豆粕粉、花生粕及蛋白胨為有機氮源（初始添加量為10g/L），分析氮源的種類對發(fā)酵的影響、優(yōu)化其組成及濃度。

在培養(yǎng)基碳氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上進一步考察不同發(fā)酵條件對突變株SC-11發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的影響。初始發(fā)酵條件為初始pH6.0，溫度為30℃，接種量為6％，依次優(yōu)化發(fā)酵初始pH（5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和 8.5）、發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40和45℃）和接種量（1％、2％、4％、6％、7％和8％），確定鼠李糖脂合成的最佳初始pH、最適溫度、接種量。

1.2.5 鼠李糖脂對Bacillus subtilis CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶的影響

1.2.5.1 鼠李糖脂的制備 從斜面接種突變株SC-11到種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后接入優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)120h后，發(fā)酵液經(jīng)離心、有機溶劑萃取及硅膠柱層析得到鼠李糖脂［13］。

1.2.5.2 結(jié)構(gòu)鑒定 采用美國安捷倫公司的Agilent Q-TOF 6520質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為：電噴霧（ESI）負離子掃描模式，質(zhì)譜掃描范圍為200-1000m/z。采用Bruker AV-300核磁共振儀。取少量分離純化后的鼠李糖脂，以DMSO-d6作為溶劑，進行波譜分析。

1.2.5.3 鼠李糖脂對Bacillus subtilis CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶的影響實驗 向產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分別加入相應(yīng)濃度的鼠李糖脂和TritonX-100。按2％接種量將Bacillus subtilis CL種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于35℃，200r/min條件發(fā)酵培養(yǎng)，定時取樣。發(fā)酵液在8000r/min下離心10min，得到的上清液即為酶液。以不添加表面活性劑的培養(yǎng)基作為對照。1.2.5.4 酶活測定 羧甲基纖維素酶（CMCase）酶活的測定：取1％的羧甲基纖維素鈉1.0mL作為底物，加入0.5mL適當稀釋的發(fā)酵酶液，在45℃水浴保溫30min，立刻加入3mL DNS試劑，沸水浴反應(yīng)5min，于540nm下測OD值。將在上述條件下每分鐘由底物產(chǎn)1μmol還原糖所需的酶量定義為一個活力單位，用IU/mL表示。木聚糖酶（Xylanase）酶活的測定：取1％的木聚糖1.0mL作為底物，加入0.5mL適當稀釋的發(fā)酵酶液，在45℃水浴保溫30min，立刻加入3mL DNS試劑，沸水浴反應(yīng)5min后，于540nm下測OD值。酶活定義同CMCase。

2 結(jié)果

2.1 等離子體處理時間對Pseudomonas aeruginosa C3的致死率

選擇合適的ARTP操作條件能夠?qū)崿F(xiàn)微生物的快速誘變。圖1可知，在1.2.2所述的設(shè)定功率下，注入離子體對菌株C3的損傷作用效果明顯，隨著等離子體射流處理時間的增加，其致死率逐漸增大。處理100s時，菌株C3幾乎全部致死。當存活率為1％-10％時，誘變處理對細胞的誘變效應(yīng)較強，所以本研究采用90s處理時間對菌株C3進行誘變。

圖1 菌株P(guān)seudomonas aeruginosa C3的致死率曲線

2.2 ARTP誘變選育鼠李糖脂高產(chǎn)突變株

出發(fā)菌株C3經(jīng)ARTP誘變處理，通過藍色凝膠平板初篩得到40株菌，將其進行搖瓶復(fù)篩實驗，產(chǎn)鼠李糖脂增幅較大的其中8株菌產(chǎn)鼠李糖脂結(jié)果（表1）表明采用藍色凝膠平板初篩結(jié)果與產(chǎn)糖脂能力基本成正比。其中突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂量最高，且該菌株傳代培養(yǎng)10次產(chǎn)糖脂量無顯著變化，遺傳性狀穩(wěn)定，表明藍色凝膠平板篩選方法是一種有效的初篩方法。通過搖瓶發(fā)酵突變株SC-11的鼠李糖脂產(chǎn)量為5.4g/L，比出發(fā)菌株提高了74.2％。

表1 菌株C3的誘變選育結(jié)果

2.3 突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

2.3.1 碳源對突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的影響 碳源種類及碳源濃度對銅綠假單胞菌產(chǎn)鼠李糖脂的影響，見圖2。銅綠假單胞菌能利用不同碳源生成鼠李糖脂，疏水性碳源比親水性碳源更適合生產(chǎn)鼠李糖脂。菜籽油對于產(chǎn)鼠李糖脂最為有利，而甘油對菌體生長最為有利。因此選取二者作為復(fù)合碳源。

向培養(yǎng)基中加入10mL/L菜籽油，再加入不同濃度的甘油，其他成分和培養(yǎng)條件不變。考察不同濃度的甘油對產(chǎn)鼠李糖脂的影響。由圖2-B可知隨著甘油濃度的增加，鼠李糖脂產(chǎn)量相應(yīng)增加，當甘油的濃度為40mL/L時，鼠李糖脂的產(chǎn)量為20.4g/L，達到最高。因此甘油的最適宜添加量為40mL/L。

2.3.2 氮源對突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的影響 在培養(yǎng)基碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，考察硝酸鈉等10種氮源對突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的影響。結(jié)果（圖3）表明，硝酸鈉最有利于鼠李糖脂的合成，而花生粕對菌體生長最為有利。以硝酸鈉為氮源時，鼠李糖脂產(chǎn)量最高達22.4g/L。鑒于硝酸鈉和花生粕分別屬于無機氮源和有機氮源，二者之間可能存在協(xié)同作用，因此選取二者作為復(fù)合氮源。

圖2 碳源種類（A）及碳源含量（B）對合成鼠李糖脂的影響

圖3 氮源種類對合成鼠李糖脂的影響

考察不同濃度的硝酸鈉和花生粕對突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的影響，結(jié)果（表2）顯示，當硝酸鈉濃度為3.5g/L，花生粕濃度為15g/L時，鼠李糖脂產(chǎn)量為34.27g/L，達到最高。因此，確定硝酸鈉濃度為3.5g/L，花生粕濃度為15g/L。

表2 硝酸鈉和花生粕濃度對合成鼠李糖脂的影響

2.3.3 發(fā)酵條件對突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的影響 采用碳氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，優(yōu)化突變株SC-11產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵條件。分別考察發(fā)酵條件初始pH值、溫度與接種量對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響，結(jié)果（圖4）表明，初始pH為6.5，溫度為35℃，接種量為6％為鼠李糖脂的適宜的發(fā)酵生產(chǎn)條件，在上述發(fā)酵條件下鼠李糖脂產(chǎn)量為42g/L。

2.4 NMR分析

參照方法1.2.5.1得到的樣品，主要由化合物1與化合物2組成。利用質(zhì)譜及核磁共振技術(shù)對兩種化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果如下：化合物1，ESIMS m/z：503［M-H］-，提示其分子量為504，結(jié)合核磁共振譜可推出其分子為式（300 MHz，DMSO-d6）δ：0.83（3H、t、J1=6.3Hz 和J2=6.9 Hz）0.85（3H、t、J1=6.4 Hz和 J2=6.4 Hz）1.24（2H，m）、1.24（3H，m）、1.52（2H，m）、1.54（2H，m）、2.38（2H，m）、2.50（1H，m）、3.40（1H，m）、3.66（1H，m）、3.68（1H，m）、3.78（s）、4.22（1H，m）、4.83（s）和 5.40（1H，m）13CNMR（75 MHz，DMSO-d6）δ ：14.0、13.9、17.2、22.5、25.0、24.5、29.0、29.1、29.3、29.6、31.6、31.7、34.4、39.0、39.4、67.8、70.4、71.1、71.3、71.5、73.3、95.4、171.3和173.7。結(jié)果表明該化合物為單鼠李糖脂。

化合物 2，ESI-MS m/z：649［M-H］-，提示其分子量為650，結(jié)合核磁共振譜可推出其分子式為（300 MHz，DMSO-d6）δ：0.85（3H、t和 J1=J2=6.4 Hz）1.10（1H，d，j=5.7 Hz）1.11（1H，d，j=5.7Hz，）1.24（1H，m），2.34（1H，m），2.43（2H，d，j=5.0Hz）、3.13（1H，m）、3.19（1H，m）、3.41（1H，m）、3.41-3.46（1H，m）、3.51（1H，m）、3.61（1H，s）、3.91（1H，m）、4.69（1H，s）、4.79（1H，s）和 5.12（H，m）。13CNMR（75 MHz，DMSO-d6）中 δ：13.9、17.7、17.8、22.1、22.0、24.0、24.7、28.6、28.8、29.0、31.2、40.1、40.3、68.7、68.8、70.1、70.2、70.5、71.5、71.9、72.1、73.2、77.1、97.7、101.2和170.2。結(jié)果表明該化合物為雙鼠李糖脂。

圖4 初始pH（A）、溫度（B）與接種量（C）對合成鼠李糖脂的影響

2.5 鼠李糖脂對Bacillus subtilis CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶的影響

近年來，通過加入表面活性劑加強細胞的通透性促進微生物產(chǎn)酶的研究得到越來越多的重視。本研究選取了Triton X-100 和鼠李糖脂添加到Bacillus subtilis CL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進行對比實驗，考察了表面活性劑對菌株CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶的影響。鼠李糖脂的添加量經(jīng)初步優(yōu)化表明，濃度為0.01％時，對Bacillus subtilis CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶促進作用最大，羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活達到最高。在此條件下，菌株CL產(chǎn)胞外酶木聚糖酶活最高達到10.12U/mL，與對照相比提高了18.3％（圖5-A）。菌株CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶活最高達到17.19U/mL，與對照相比提高了12.9％（圖5-B）。而TritonX-100對菌株CL產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶均有明顯的抑制作用。

3 討論

關(guān)于鼠李糖脂高產(chǎn)菌株的篩選的報道有很多。沈微等［14］采用紫外線照射與UV+LiCl復(fù)合誘變的手段，對P. aeruginosa BS-03的野生型菌株進誘變，獲得出一株高產(chǎn)正突變株，鼠李糖脂產(chǎn)量與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了65.85％，達到6.8g/L。秦新政等［15］用產(chǎn)物誘變的方法篩選到一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株，使鼠李糖脂產(chǎn)量比出發(fā)提高了57.14％。然而通過ARTP誘變育種方法誘變選育鼠李糖脂高產(chǎn)菌株并未報道過。本研究的篩選結(jié)果表明ARTP誘變育種方法可快速有效地誘變鼠李糖脂高產(chǎn)菌株，該菌株的誘變篩選為進一步工業(yè)化應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

底物轉(zhuǎn)化率對于鼠李糖脂的工業(yè)化應(yīng)用十分重要，目前鼠李糖脂產(chǎn)量一般為30-40g/L左右，底物轉(zhuǎn)化率相對較低。例如，馬滿英等［16］報道的假單胞菌AB93066鼠李糖脂產(chǎn)量為56g/L，產(chǎn)率為0.47 g/g底物。時進剛等［17］報道的的銅綠假單胞菌AB93066鼠李糖脂產(chǎn)量為30-40g/L，產(chǎn)率為0.67 g/g底物。Giani等［18］報道銅綠假單胞菌DSM 7108和DSM 2874的鼠李糖脂產(chǎn)量為70-120g/L，產(chǎn)率為0.68 g/g底物。而本研究經(jīng)過優(yōu)化后鼠李糖脂搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為42g/L，產(chǎn)率為0.7 g/g底物，具有較高的產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率。

圖5 表面活性劑對Bacillus subtilis CL產(chǎn)木聚糖酶（A）及羧甲基纖維素酶的影響（B）

鼠李糖脂促進微生物（多為真菌）產(chǎn)胞外酶的研究已有報道。例如Liu等［19］報道的鼠李糖脂促進黃孢原毛平革菌產(chǎn)的羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活分別提高了13.25％和16.27％。Wang等［20］報道的鼠李糖脂使青霉菌產(chǎn)的羧甲基纖維素酶活提高了48.5％。劉佳等［19］報道的鼠李糖脂使綠色木酶產(chǎn)的羧甲基纖維素酶活提高了1.6倍。一般認為提高酶活的主要原因是表面活性劑改變了微生物細胞膜的滲透性，微生物所分泌的胞外酶更加容易透過細胞膜運輸?shù)郊毎獠浚?1］。本研究通過添加微量的鼠李糖脂使枯草芽孢桿菌產(chǎn)的羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活分別提高了12.9％和18.3％。微量的鼠李糖脂通過加強細胞通透性來提高酶活，而對發(fā)酵菌體影響小，這一特性有望應(yīng)用于其它胞外酶的研究。

4 結(jié)論

通過對出發(fā)菌株進行常壓室溫等離子體誘變選育，獲得了生物表面活性劑鼠李糖脂高產(chǎn)誘變菌株SC-11，鼠李糖脂產(chǎn)量達到5.4g/L，比出發(fā)菌株提高了74.1％。進一步對產(chǎn)鼠李糖脂的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，搖瓶優(yōu)化后的鼠李糖脂產(chǎn)量可達42g/L，產(chǎn)率為0.7 g/g底物，具有較高的底物轉(zhuǎn)化率。

研究考察了通過發(fā)酵所得的鼠李糖脂對液態(tài)發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶與木聚糖酶的影響。結(jié)果表明，添加0.01％的鼠李糖脂對枯草芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶有促進作用，使羧甲基纖維素酶活與木聚糖酶活分別提高12.9％和18.3％，酶活分別達到17.19U/mL和10.12U/mL。

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