靳進樸 郭安源，2 何坤，3 張禾，4 朱其慧，5 陳新 高歌 羅靜初

基因表達調(diào)控在動植物生長發(fā)育過程中具有重要作用，是植物適應外界環(huán)境的分子基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄調(diào)控通過轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor）蛋白質(zhì)序列中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和靶基因上游啟動子區(qū)域特異DNA序列模體結(jié)合而實現(xiàn)。除DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）外，轉(zhuǎn)錄因子通常還包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域（Transcription regulation domain），主要用于調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性，既可激活轉(zhuǎn)錄，也可抑制轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子中的核定位信號（Nuclear localization signal，NLS）可引導轉(zhuǎn)錄因子在胞漿內(nèi)合成后通過核膜進入細胞核。此外，有些轉(zhuǎn)錄因子含寡聚化結(jié)構(gòu)域可形成二聚體或多聚體復合物，具有更為復雜的調(diào)控機制。

轉(zhuǎn)錄因子種類繁多、功能復雜，它們通過與靶基因啟動子結(jié)合，激活或抑制其轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控靶基因在不同組織、不同細胞、不同環(huán)境條件下特異表達，并通過轉(zhuǎn)錄因子級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡，對許多生命過程進行調(diào)控。例如，果蠅體節(jié)發(fā)育由一類稱為同源異型框（Homeobox）的基因調(diào)控，它們所編碼的蛋白質(zhì)為轉(zhuǎn)錄因子，含長度為60個氨基酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。植物特異轉(zhuǎn)錄因子家族SQUAMOSA promotor binding protein（SBP）成員具有調(diào)控玉米果實發(fā)育和水稻分蘗等多種功能。

20世紀90年代開始的人類基因組計劃，開創(chuàng)了生命科學研究的新時代。人類基因組計劃指定的模式生物釀酒酵母、秀麗線蟲和果蠅的基因組測序于2000年前先后完成。擬南芥基因組測序于2000年底完成。2000年12月15日，就在Nature雜志發(fā)表擬南芥基因組序列分析論文［1］的第2天，Science雜志發(fā)表了題為《擬南芥轉(zhuǎn)錄因子：從基因組水平上比較真核生物轉(zhuǎn)錄因子》的論文［2］，首次系統(tǒng)預測了擬南芥基因組中的1533個轉(zhuǎn)錄因子，將它們分為28個家族，并與酵母、線蟲和果蠅等其它3個真核生物進行了系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子在整個基因組中所占比例遠高于上述3個物種。

2004年，北京大學生命科學學院朱玉賢、鄧興旺主持的國家自然科學基金國際合作項目，對擬南芥中預測到的轉(zhuǎn)錄因子按家族逐個克隆，并對結(jié)果進行了初步分析［3］。為配合該課題的順利進行，我們構(gòu)建了擬南芥轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［4］（Database of Arabidopsis transcription factors，DATF）。DATF 中 預測到的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)共1922個，分為64個家族。此后不久，水稻和楊樹基因組序列發(fā)布，我們又先后構(gòu)建了水稻轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［5］（Database of rice transcription factors，DRTF）和楊樹轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［6］（Database of poplar transcription factors，DPTF）。與此同時，苔蘚類植物小立碗蘚（Physcomitrella patens）和綠藻類植物萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）基因組測序也先后完成，我們又構(gòu)建了植物主要譜系中這兩個代表性物種的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫。

截止2007年，玉米、高粱、棉花、大豆、葡萄等重要經(jīng)濟作物的基因組測序尚未完成，但美國愛荷華州立大學植物基因組數(shù)據(jù)庫PlantGDB收錄了大量植物代表性轉(zhuǎn)錄本（Plant unique transcripts，PUT）序列數(shù)據(jù)［7］。這些PUT序列是由表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）拼接而成，有些是全長mRNA序列，有些則是mRNA序列片段。我們從17個物種PUT序列中預測了轉(zhuǎn)錄因子，并和上述DATF等5個已完成基因組測序物種的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫整合在一起，構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫［8］（Plant transcription factor database，PlantTFDB），為植物基因組學、遺傳學和植物分子生物學研究提供寶貴的數(shù)據(jù)資源。2010年，玉米、高粱、大豆、葡萄等18個被子植物，代表性蕨類植物江南卷柏（Selaginella moellendorffii），以及9個綠藻基因組測序相繼完成。此外，PlantGDB數(shù)據(jù)庫也進行了更新，并增加了不少新物種。與此同時，許多轉(zhuǎn)錄因子家族、特別是植物特異轉(zhuǎn)錄因子家族的起源、演化、功能等研究成果相繼發(fā)表，轉(zhuǎn)錄因子家族分類也得以更新。為此，我們對PlantTFDB進行了大規(guī)模更新，更新后的第2版包括從49個物種中預測到的53 315個轉(zhuǎn)錄因子，分為58個家族［9］。隨著基因組測序技術(shù)不斷改進，測序速度不斷加快。2013年，已有67種植物的基因組測序完成，我們對PlantTFDB再次進行更新。更新后的第3版共包括129 288個轉(zhuǎn)錄因子，來自83個物種，其中67個已完成基因組測序，覆蓋綠色植物各大門類［10］。

本文介紹植物轉(zhuǎn)錄因子分類規(guī)則和預測方法，以及植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB的概況和注釋信息。

1 植物轉(zhuǎn)錄因子家族分類

轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DBD在很大程度上決定其與基因上游啟動子區(qū)域DNA順式元件結(jié)合的序列特異性［11］。DBD在演化上比較保守，通常用作區(qū)分不同轉(zhuǎn)錄因子家族的主要依據(jù)。2000年，Riechmann等［2］歸納整理了擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子家族及其特征，將其分為28個家族。10多年來，我們先后檢索和閱讀了大量植物轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)文獻，文章總數(shù)累計達7 000余篇。在Riechmann等工作基礎(chǔ)上，根據(jù)已有文獻報道，總結(jié)了植物轉(zhuǎn)錄因子家族及其結(jié)構(gòu)域序列特征，改進了植物轉(zhuǎn)錄因子家族分類規(guī)則，并不斷加以修改和完善，用于植物轉(zhuǎn)錄因子家族劃分和植物基因組中未知轉(zhuǎn)錄因子的預測（圖1）。

圖1 植物轉(zhuǎn)錄因子家族分類規(guī)則

1.1 單一DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域

一般說來，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列中所含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域種類，即可確定其屬于某個特定家族。第3版PlantTFDB數(shù)據(jù)庫58個轉(zhuǎn)錄因子家族中，36個家族（~62％）符合這種家族與DBD一一對應的簡單規(guī)則，如調(diào)控植物生長發(fā)育的乙烯不敏感（Ethylene insensitive-like，EIL）轉(zhuǎn)錄因子家族均含EIN結(jié)構(gòu)域，調(diào)控植物花、果實發(fā)育的SQUAMOSA基因啟動子結(jié)合蛋白（SQUAMOSA-promoter binding protein，SBP）均含SBP結(jié)構(gòu)域。

1.2 禁止結(jié)構(gòu)域

除上述具有簡單對應關(guān)系的轉(zhuǎn)錄因子外，某些蛋白質(zhì)家族情況比較復雜。例如，由兩個半胱氨酸（Cys，C）和兩個組氨酸（His，H）組成的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，是重要的蛋白質(zhì)序列模體。這類蛋白質(zhì)分子中，有些能與DNA結(jié)合，具有轉(zhuǎn)錄活性；有些則與RNA結(jié)合，具有核酸酶活性，除了能與RNA結(jié)合的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)外，它們同時包含核酸酶相關(guān)RNase_T結(jié)構(gòu)域。因此，我們將RNase_T結(jié)構(gòu)域稱為“禁止結(jié)構(gòu)域”（Forbidden domain），用來降低轉(zhuǎn)錄因子預測中含C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)預測的假陽性率。又如，半胱氨酸型肽段內(nèi)切酶MCP1B和AtMC2均具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域Zf-LSD，但目前尚無證據(jù)表明它們具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。我們用禁止結(jié)構(gòu)域“Peptidase_C14”用來濾除包含Zf-LSD結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)中的非轉(zhuǎn)錄因子。除上述兩個家族外，C3H和MYB家族也含禁止結(jié)構(gòu)域。

1.3 輔助結(jié)構(gòu)域

有些轉(zhuǎn)錄因子中除了DBD外，還有其它一些特征結(jié)構(gòu)域，稱為“輔助結(jié)構(gòu)域”（Auxiliary domain）。輔助結(jié)構(gòu)域也可用作轉(zhuǎn)錄因子家族分類的依據(jù)。例如，生長調(diào)控因子（Growth regulation factor，GRF）轉(zhuǎn)錄因子家族中均含WRC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中的特征序列為色氨酸（Trp，W）-精氨酸（Arg，R）-半胱氨酸（Cys，C）序列模體WRC。但并非所有含WRC序列模體的蛋白質(zhì)都具有轉(zhuǎn)錄活性，只有既有WRC序列模體又有QLQ序列模體［谷氨酰胺（Gln，Q）-亮氨酸（Leu，L）- 谷氨酰胺（Gln，Q）］的蛋白質(zhì)才是轉(zhuǎn)錄因子。

1.4 DBD結(jié)構(gòu)域數(shù)

有些轉(zhuǎn)錄因子中含兩個或兩個以上DBD，因此，DBD數(shù)目也常常用來區(qū)分不同轉(zhuǎn)錄因子家族。典型實例為AP2和ERF家族。這兩個家族轉(zhuǎn)錄因子中均含AP2結(jié)構(gòu)域，同屬于AP2/ERF超家族，其中僅含一個AP2結(jié)構(gòu)域的為ERF家族，含兩個或兩個以上的則為AP2家族。又如，MYB轉(zhuǎn)錄因子超家族均含Myb_dna_bind結(jié)構(gòu)域，僅含一個的為MYB_related家族，而含兩個或兩個以上的為MYB家族。

1.5 超家族

除上述基于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、利用禁止結(jié)構(gòu)域和輔助結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌D(zhuǎn)錄因子家族進行分類外，有些轉(zhuǎn)錄因子家族之間的關(guān)系比較復雜。例如，具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域G2-like的轉(zhuǎn)錄因子均屬于GARP超家族，其中同時還含Response_reg結(jié)構(gòu)域，而有的則僅有G2-like結(jié)構(gòu)域。我們將僅含G2-like結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子歸為G2-like家族，而把兼有G2-like和Response_reg結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子歸為ARR-B家族。

更為復雜的是，AP2/ERF超家族中的另外一個家族RAV同時含有兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個為AP2，另一個為B3。而B3結(jié)構(gòu)域又是另外一個超家族B3中兩個家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該超家族中僅含B3結(jié)構(gòu)域的為B3家族，同時含B3結(jié)構(gòu)域和Auxin_resp輔助結(jié)構(gòu)域的為ARF家族。

具有同源異型結(jié)構(gòu)域（Homeodomain）的轉(zhuǎn)錄因子是一個具有多個家族的超家族，根據(jù)是否具有輔助結(jié)構(gòu)域及輔助結(jié)構(gòu)域類別，可細分為HD-ZIP、TALE、WOX等家族。

2 植物轉(zhuǎn)錄因子預測

2.1 預測方法

利用上述家族分類規(guī)則，可以將文獻中已經(jīng)報道的植物轉(zhuǎn)錄因子分為若干家族，并以此為依據(jù)預測已經(jīng)完成基因組測序的綠色植物基因組中未知轉(zhuǎn)錄因子。早期的預測主要采用BLAST序列相似性搜索，即以不同家族的已知轉(zhuǎn)錄因子DBD序列為檢測序列，設置恰當?shù)膮?shù)，用安裝到本地的BLAST軟件包，逐個搜索不同物種基因組中蛋白質(zhì)編碼序列，并對搜索結(jié)果進行計算機和人工篩選，剔除假陽性結(jié)果。

基于隱馬氏模型（Hidden markov model，HMM）的序列分析軟件包HMMER在蛋白結(jié)構(gòu)域識別方面具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)勢，多用于預測同一家族的遠緣同源序列［12］。其主要原理為適當選取若干已知種子序列并進行多序列比對，基于隱馬氏模型對序列比對結(jié)果進行分析并構(gòu)建隱馬氏模型，給出模型參數(shù)。因此，我們采用HMMER軟件包為主要轉(zhuǎn)錄因子預測工具。歐洲生物信息學研究所（European bioinformatics institute，EBI）Bateman領(lǐng)導的研究組，利用HMMER軟件包構(gòu)建了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫Pfam［13］。該數(shù)據(jù)庫還無償提供他們構(gòu)建的用于預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的隱馬氏模型。上述轉(zhuǎn)錄因子分類規(guī)則中共用到63個隱馬氏模型，其中52個取自Pfam數(shù)據(jù)庫，另外11個當時發(fā)布的第27版（Pfam V27.0）尚未公布。為此，基于文獻和收集到的轉(zhuǎn)錄因子序列，利用HMMER軟件包，我們構(gòu)建了這11個結(jié)構(gòu)域的隱馬氏模型，用于預測植物基因組中的轉(zhuǎn)錄因子（表1）。為提高預測的準確性，我們基于GO注釋［14］、擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫［15］（The Arabidopsis information resource，TAIR）和國際蛋白質(zhì)序列和功能知識庫UniProtKB［16］等相關(guān)信息，人工檢查序列比對結(jié)果，并參考Pfam確定閾值的方法，為每個結(jié)構(gòu)域模型確定了一個閾值。

基于上述方法和隱馬氏模型，我們構(gòu)建了植物轉(zhuǎn)錄因子預測流程，用于預測植物基因組中未知轉(zhuǎn)錄因子［17］。

表1 用于轉(zhuǎn)錄因子預測的隱馬氏模型

2.2 預測平臺

上述用于轉(zhuǎn)錄因子預測的隱馬氏模型可免費提供國內(nèi)外用戶，便于用戶自行構(gòu)建本地轉(zhuǎn)錄因子預測系統(tǒng)，從基因組水平系統(tǒng)預測新測定的基因組中未知轉(zhuǎn)錄因子。為方便不具備自行構(gòu)建本地轉(zhuǎn)錄因子預測系統(tǒng)的廣大用戶，我們在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中構(gòu)建了在線轉(zhuǎn)錄因子預測平臺，用戶可以上載序列，預測未知蛋白序列中的轉(zhuǎn)錄因子。目前，模式植物擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制研究最為清楚，在PlantTFDB中注釋信息也最為詳盡。用戶若在提交頁面勾選“Best hit in Arabidopsis thaliana”，預測結(jié)果中則包括相似擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的超鏈接，供用戶參考。

3 植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

3.1 數(shù)據(jù)庫概況

2013年更新的第3版植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB收錄了從83個物種預測到的129 288個轉(zhuǎn)錄因子，分屬58個家族（表2）。這83個物種覆蓋了綠色植物各大譜系，包括10個綠藻、1個苔蘚植物、1個蕨類植物、4個裸子植物、1個被子植物基部類群、17個單子葉植物和49個雙子葉植物。裸子植物中歐洲云杉（Picea abies）的基因組測序已經(jīng)完成，填補了舊版PlantTFDB中沒有裸子植物全基因組預測所得轉(zhuǎn)錄因子的空白。顯然，這83個物種中，被子植物占絕大多數(shù)（~81％），包括單子葉植物水稻、玉米、高粱、小麥、大麥等主要糧食作物，雙子葉植物中棉花、煙草、大豆、番茄、馬鈴薯、黃瓜、西瓜等重要經(jīng)濟作物，以及葡萄、蘋果、梨、橙、橘等水果，為作物分子育種研究提供了寶貴資源。而與模式植物擬南芥同一屬的琴葉擬南芥（Arabidopsis lyrata）、同為十字花科的小鹽芥（Thellungiella halophila）和條葉藍芥（Thellungiella parvula）的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)，則為轉(zhuǎn)錄因子家族的起源、演化和功能研究提供了基礎(chǔ)。

植物從水生到陸生的演變是生命演化史上的重要事件。橫跨綠色植物各大分支的轉(zhuǎn)錄因子全譜的發(fā)布，使我們可以從轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平研究這一重要歷史進程。與綠藻相比，陸生植物無論在轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)目、轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目及轉(zhuǎn)錄因子在基因組中所占比例等方面都明顯高于綠藻，與陸生植物更加復雜的多細胞形態(tài)發(fā)育相關(guān)［18］。

3.2 數(shù)據(jù)庫注釋

高質(zhì)量的注釋信息是植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB的重要特色。通過查看注釋信息，從事植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的生物學工作者可獲取該轉(zhuǎn)錄因子序列、功能、表達、調(diào)控等相關(guān)信息，并通過文獻信息了解其研究現(xiàn)狀。PlantTFDB中的注釋信息可以分為兩個層次，第一個層次為單個轉(zhuǎn)錄因子的注釋，第二個層次為家族水平的注釋。

單個轉(zhuǎn)錄因子的注釋，除名稱、序列、結(jié)構(gòu)域等基本信息外，也包括與其它重要數(shù)據(jù)庫的鏈接。此 外， 我 們 從 TAIR、UniProtKB和 AthMap［19］等公共數(shù)據(jù)庫中全面收集專家校驗的功能描述、結(jié)合位點/矩陣、microRNA調(diào)控、激素調(diào)控、相互作用、突變和表型等信息。同時，還通過整合Entrez Gene［20］、GeneRIF［20］以及通過文本挖掘和人工校驗獲得的文獻信息［18］，為收錄的轉(zhuǎn)錄因子提供了相關(guān)的參考文獻列表。此外，我們還收錄了分別基于9個十字花科物種的基因組比對和20個被子植物基因組比對所得到的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點保守元件序列［21，22］（表 3）。

家族水平的注釋除了該家族簡介和相關(guān)文獻信息外，還包括該家族成員的演化信息，包括所有物種每個家族成員和每個物種內(nèi)每個家族成員兩類比對信息，以序列圖標（Sequence logo）（圖2-A）和系統(tǒng)發(fā)生樹方式（圖2-B）展示。

4 結(jié)論與展望

自2005年首次發(fā)表擬南芥轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫DATF［4］至今已有10年，10年來，我們不斷擴充和多次更新植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB。在此期間，德國波茨坦大學、丹麥奧胡斯大學、美國俄亥俄州立大學、日本理化學研究所等單位也構(gòu)建了相應的植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（表4）。與這些數(shù)據(jù)庫相比，PlantTFDB包括的物種最多、注釋信息最豐富、更新最及時。目前，該數(shù)據(jù)庫年訪問量逾千萬次，已成為植物轉(zhuǎn)錄因子功能和演化研究的權(quán)威數(shù)據(jù)庫和重要數(shù)據(jù)資源，我們構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)錄因子家族分類規(guī)則也被國內(nèi)外同行用于新測序物種轉(zhuǎn)錄因子預測。

表2 植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB中83個物種轉(zhuǎn)錄因子及其家族統(tǒng)計

續(xù)表

利用上述數(shù)據(jù)庫資源，我們與其他課題組合作，對AP2/EREBP、MYB、SBP等植物轉(zhuǎn)錄因子家族進行了演化和功能分析［32-34］。同時，對擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡進行了深入分析，揭示了植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡在結(jié)構(gòu)和演化上的新特征［18］。

表3 轉(zhuǎn)錄因子個體水平注釋

圖2 轉(zhuǎn)錄因子家族水平注釋

不言而喻，隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，更多植物基因組測序?qū)⑼瓿?，大量基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不斷發(fā)布。隨著轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究不斷深入，轉(zhuǎn)錄因子分類規(guī)則有待改進。此外，SELEX等高通量DNA結(jié)合特異性測定技術(shù)的發(fā)展，為深入研究植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了新的契機。結(jié)合表達數(shù)據(jù)、啟動子區(qū)域和保守元件等信息，預測轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因，進而構(gòu)建高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，探索轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，必將成為新的研究熱點。開發(fā)轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析平臺，將植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫與數(shù)據(jù)分析整合起來，則是下一步研究目標。

表 4 國際上主要植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫

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