羅夢圓 紀家葵

誘導(dǎo)胚胎干細胞體外分化為生殖細胞對于臨床醫(yī)學(xué)實踐和人類生殖細胞發(fā)育機理的理論研究兩方面都具有重要意義。近年來，有多篇研究報道誘道小鼠或人的胚胎干細胞分化可以觀察到類原始生殖細胞、類精子和類卵細胞的結(jié)構(gòu)形成。早在2006年，Nayernia 等［1］就將小鼠胚胎干細胞誘導(dǎo)形成完全成熟并具有生理功能的精子，可使小鼠卵細胞受精，此受精卵植入小鼠卵巢可產(chǎn)下后代。但迄今仍未能從人類胚胎干細胞誘導(dǎo)出完全成熟并具有一定生理功能的卵細胞。要想獲得這樣的卵細胞，目前還有很多問題尚未解決，其中之一就是如何能有效檢測胚胎干細胞分化的階段。解決這一問題的有效手段之一是建立人胚胎干細胞向卵細胞分化的報告系統(tǒng)，將在卵細胞中特異表達基因的啟動子與熒光蛋白相連接，通過熒光蛋白的表達來指示胚胎干細胞體外分化的卵細胞階段。2009年，Kee等［2］在誘導(dǎo)人胚胎細胞分化的過程中就使用了VASA-eGFP檢測系統(tǒng)，將VASA基因啟動子與eGFP蛋白的序列相連接，慢病毒感染人的胚胎干細胞，成功檢測并分離出分化的人胚胎干細胞中的原始生殖細胞群體。

ZP2（Zona pellucida 2）是組成卵細胞透明帶的重要蛋白之一。透明帶由哺乳動物分泌的糖蛋白組成，包圍在卵母細胞周圍，對于哺乳動物受精過程中的精卵識別、精卵結(jié)合以及避免多次受精現(xiàn)象有非常重要的作用［3］。ZP2和另一種組成透明帶的重要蛋白ZP3是已知的為數(shù)不多的僅在卵細胞中表達的蛋白，表達具有很高的組織特異性［4］。ZP2蛋白在表達后受到多種糖基化修飾［5］，與ZP3蛋白形成異源二聚體結(jié)構(gòu)［6］，最終形成透明帶。在功能上，ZP2與已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子直接結(jié)合，是結(jié)合精子的第二受體［7］。Zp2敲除的小鼠卵母細胞透明帶變薄，無法正常排卵，即便取出這樣的小鼠的卵細胞在體外培養(yǎng)成熟并受精，得到的胚胎也無法正常發(fā)育［8］。人和小鼠的ZP2基因非常保守，在它們的5'末端有一段575bp的片段，其中有超過70％的堿基是一致的［9］。重組表達人ZP2蛋白的Zp2敲除小鼠，其透明帶的缺陷能得到部分修復(fù)［10］。ZP2的轉(zhuǎn)錄始于原始卵泡期之后，受到原始卵泡階段重要的轉(zhuǎn)錄因子Figlα的調(diào)控［11］。此后，隨著卵泡發(fā)育迅速上升，在卵細胞發(fā)育到半徑為50-60 μm時達到最高值，在卵子成熟及排卵開始時迅速降至最高值的5％以下［12］。ZP2的表達特異性使得其很適合作為指示卵母細胞發(fā)育階段的標(biāo)志基因。

本研究利用不同長度的ZP2啟動子片段與熒光蛋白eGFP相連接構(gòu)建出熒光報告質(zhì)粒。由于人類胚胎干細胞有不易被轉(zhuǎn)染的特點，因此報告系統(tǒng)采用慢病毒感染的方式植入ZP2報告系統(tǒng)［13］。同時用人成纖維細胞WI38進一步檢驗該報告系統(tǒng)的組織特異性。由于人卵母細胞樣本珍貴、不易取得，本實驗暫采用小鼠卵母細胞，通過體外培養(yǎng)和熒光觀察篩選出能特異指示卵母細胞的報告系統(tǒng)，旨為人類胚胎干細胞分化、卵母細胞的鑒定及卵母細胞的分離提供良好的工具和手段。

1 材料與方法

1.1 材料

293FT細胞培養(yǎng)液成分：DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）， 胎 牛 血 清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），Glutamax，非必需氨基酸（Non-essential amino acid，NEAA），Pen/strip，Sodium Pyruvate，G418（Geneticin，遺傳霉素）。H9細胞培養(yǎng)液成分：Knockout DMEM（Knockout dulbecco’s modified eagle medium），血清替代物（Knockout Serum Replacer，KSR），Glutamax，NEAA，Pen/Strep，人基礎(chǔ)成纖維細胞生長因子（Human Basic Fibroblast Growth Factor，hbFGF）。WI38細胞培養(yǎng)液成分：最低基礎(chǔ)培 養(yǎng) 液（Minimum essential medium，MEM），F(xiàn)BS，NEAA，Pen/Strep。以上試劑均購自Gibco公司。小鼠卵母細胞培養(yǎng)和顯微操作用試劑：M2培養(yǎng)液（邁晨），M16培養(yǎng)液（邁晨），礦物油（Sigma）。構(gòu)建重組質(zhì)粒所用試劑盒pENTR 5'-TOPO TA cloning Kit（Invitrogen），pENTR Directional TOPO cloning Kit（Invitrogen），Gateway LR Clonase Ⅱ Plus Enzyme Mix Kit（Invitrogen）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所用試劑：opti-MEM（Gibco），Lipofectamin 2000（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 人ZP2啟動子300bp和2500bp片段的克隆人ZP2啟動子片段根據(jù)已知序列（Enrez Gene ID：7783）進行引物設(shè)計（表1），模板為人WI38細胞的基因組DNA（基因組的提取按照DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGEN）使用說明進行）。利用Taq聚合酶（Invitrogen）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積為50μL，其中 5μL 10×buffer-MgCl2，1μL 10mmol/L dNTP，1μL10μmol/L hZP2-300-F primer/ hZP2-2500-F primer，1μL 10μmol/L hZP2-R primer，4μL 57ng/mL WI38genome，0.2μL Taq Polymerase，38.3μL ddH2O。反應(yīng)程序 ：94℃ 5min ；94℃ 30s，60℃/65℃ 30s，72℃ 30s（300bp片段）/2min 30s（2500bp 片段），共35個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Invitrogen公司測序確認。

1.2.2 慢病毒包裝 所有病毒包裝用質(zhì)粒使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN）進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提。病毒包裝用293FT細胞鋪在175cm2培養(yǎng)瓶中，待細胞密度約90％時可用于病毒包裝。病毒包裝液A：120μL Lipofectamine + 5mL Opti-MEM，包裝液 B ：10μg病毒包裝質(zhì)粒 Vsvg+ 15μg 病毒包裝質(zhì)粒?8.9+ 10μg ZP2報告載體 + 10mL Opti-MEM. 室溫靜置混合液A和B 5min，將A和B振蕩混合，室溫靜置20min。之后移除293FT細胞中原有培養(yǎng)液，將AB混合溶液均勻鋪在細胞表面，37℃恒溫箱中培養(yǎng)6h后棄掉培養(yǎng)瓶中的AB混合液，加入18mL 293FT細胞培養(yǎng)液（不含G418和PEN/STRIP）。將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入慢病毒培養(yǎng)室中37℃恒溫培養(yǎng)72h。之后收集培養(yǎng)瓶中的懸浮液入50mL離心管中，2000r/min離心5min，上清用Millex-HV 0.45μm的濾器過濾。產(chǎn)物在-80℃條件下保存。

表1 PCR反應(yīng)所用引物序列

1.2.3 未分化H9細胞的病毒感染 用于感染的H9細胞鋪在經(jīng)matrigel（BD）預(yù)處理的6孔板中至密度50％時用于病毒感染。移除細胞中原有的培養(yǎng)液，每孔加入1mL病毒原液。37℃恒溫培養(yǎng)6h后每孔補充2mL完全培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。24h后棄去細胞中病毒溶液，每個孔加入2mL完全培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜后棄去培養(yǎng)液，用含blasticidin的培養(yǎng)液篩選出已被成功感染的細胞，連續(xù)篩選3-5d，每天更換一次培養(yǎng)液。

1.2.4 細胞DAPI染色和熒光顯微觀察 細胞棄去原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次后，加入適量4％多聚甲醛（完全覆蓋細胞表面即可），室溫固定15min。去除多聚甲醛，PBS清洗后，加入含1μg/mL DAPI染料的PBS，避光染色20min。棄去染液，PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 小鼠卵母細胞的顯微注射和體外培養(yǎng) 小鼠卵母細胞從12周齡B6D2F1小鼠卵巢中獲得，置于在M2培養(yǎng)液中。利用Eppendof NK2顯微操作儀，將吸卵針連接到控制器上，調(diào)整到合適位置。向注射針中加入待注射質(zhì)粒，質(zhì)粒需用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提方法提取，并溶解在分子生物學(xué)級H2O中，再將注射針連接控制器。向培養(yǎng)皿蓋上滴加一滴M2培養(yǎng)液（5-10μL），并用礦物油封住液滴后，將之移至載物臺上。調(diào)整兩操作臂，使兩針均浸入M2液滴中，使之接近培養(yǎng)皿底部，但不能觸底。將準備好的卵母細胞移入該液滴，吸卵針保持卵母細胞位置，注射針將一定量報告質(zhì)粒注射入卵母細胞細胞核中。注射完畢的小鼠卵母細胞轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，再熒光觀察。

2 結(jié)果

2.1 人ZP2啟動子300bp和2 500bp片段報告載體的構(gòu)建

根據(jù)人ZP2基因啟動子序列設(shè)計相應(yīng)上下游引物（表1），以WI38細胞系基因組為模板，PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物通過DNA電泳檢測，在預(yù)期片段大小位置有特異條帶（圖1）。回收該條帶并通過酶切連接到pENTR-5'-TOPO載體，產(chǎn)物經(jīng)測序確定序列和插入方向無誤。將帶有ZP2基因啟動子的重組質(zhì)粒pENTR-5'-ZP2 promoter與帶有報告基因eGPF的質(zhì)粒pENTR-D-eGFP和2k7bsd質(zhì)粒混合，其上帶有的同源重組的位點發(fā)生重組得到ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP重組質(zhì)粒，經(jīng)測序檢驗插入位點和序列無誤。

圖1 人ZP2啟動子300bp（A）和2500bp（B）片段PCR結(jié)果

2.2 帶有人ZP2啟動子報告載體的慢病毒包裝和滴度測定

重組質(zhì)粒經(jīng)過去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提后用于病毒的包裝，用于包裝病毒的293FT細胞在轉(zhuǎn)染帶有人ZP2啟動子報告載體的重組質(zhì)粒和包裝病毒的輔助質(zhì)粒72h后可以觀察到預(yù)期的細胞凋亡現(xiàn)象，此時收集到的細胞上清液中含有大量帶人ZP2報告載體的慢病毒（圖2）。

病毒滴度用單位體積的病毒懸液所能感染的細胞數(shù)目表示。將獲取的病毒懸液稀釋到不同濃度后感染W(wǎng)I38細胞，用含2μg/mL blasticidin的細胞培養(yǎng)液篩選4d，計算篩選后的剩余細胞數(shù)，計算得出病毒滴度（表2）。滴度在104及以上的病毒可用于后續(xù)實驗。

圖2 帶有人ZP2啟動子報告載體的慢病毒包裝結(jié)果

表2 慢病毒滴度測定結(jié)果

2.3 帶有人ZP2啟動子300bp和2500bp片段報告載體在非卵細胞中無報告熒光表達

將帶有人ZP2啟動子300bp和2500bp片段報告載體的慢病毒感染W(wǎng)I38（人成纖維細胞）和未分化H9（人胚胎干細胞系）細胞，陽性對照使用EF1α-eGFP病毒感染293FT細胞，一定濃度的blasticidin篩選4d后進行熒光顯微觀察，結(jié)果（圖3）顯示兩種報告載體慢病毒在感染W(wǎng)I38和未經(jīng)分化的H9細胞后都無綠色熒光蛋白表達，而陽性對照細胞中可以觀察到明顯的綠色熒光。

2.4 帶有人ZP2啟動子2500bp片段的報告載體在小鼠卵細胞中檢測到報告熒光

圖3 ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP病毒分別感染W(wǎng)I38細胞和未分化的H9細胞后熒光觀察結(jié)果

從12周大小的B2D6F1雌性小鼠的卵巢中取得小鼠GV（Germinal vesicle）期卵母細胞，放入M2培養(yǎng)液培養(yǎng)，將帶有人ZP2啟動子片段的報告載體顯微注射入GV期卵母細胞的細胞核中，注射后卵母細胞轉(zhuǎn)入M16培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察細胞熒光。對照組細胞從小鼠卵巢中取出后未進行注射處理即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，注射ZP2-2500-eGFP質(zhì)粒的小鼠卵母細胞可觀察到綠色熒光，而注射ZP2-300-eGFP質(zhì)粒和對照組細胞無綠色熒光。將有綠色熒光的卵母細胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后再次進行觀察，仍能觀察到微弱綠色熒光。的難點之一。2003年，Hubner等［14］首次由小鼠胚胎干細胞自發(fā)分化得到卵細胞。此后Gejisen等［15］將小鼠胚胎干細胞分化為胚體，利用SSEA1作為篩選標(biāo)記富集其中的原始生殖細胞，視黃酸體外誘導(dǎo)分化出類似精子的細胞，將其顯微注射入小鼠卵細胞后能發(fā)育到囊胚時期。2006年，Nayernia等［1］利用Stra8和Prm1報告系統(tǒng)，將小鼠胚胎干細胞體外分化類似精子的細胞，用其受精后的卵細胞再植入小鼠體內(nèi)并成功獲得了后代，但這些后代在體型大小上與正常小鼠不同，且都在未成年之前死亡。2011年，Hayashi等［16］用 SSEA1和 Integrinβ3作為篩選標(biāo)記，從誘導(dǎo)分化的小鼠胚胎干細胞篩選出原始生殖細胞，移植回小鼠睪丸后發(fā)育為成熟精子，用這種方法獲得的精子能使小鼠卵細胞受精并發(fā)育為成熟后代。2012年，該作者又用類似的方法獲得了小鼠的成熟卵細胞，這種卵細胞能被正常小鼠精子受精并發(fā)育為成熟后代［17］。另一方面，在人類胚胎干細胞的研究中，早期多采用簡單流式分選或標(biāo)記蛋白流式分選的方式來分離分化得到的原始生殖細胞，但一直未能獲得單倍體［18，19］。2009年，Kee等［2］采用VASA-eGFP報告系統(tǒng)，從BMPs誘導(dǎo)分化的人類胚胎干細胞中富集原生殖細胞，并通過高表達內(nèi)源因子DAZLBOULEDAZ的方式最終獲得單倍體精細胞。但至今尚未有成功將人胚胎干細胞體外分化有功能的成熟卵細胞的研究報道。

使用體外分化方式獲得人類成熟卵細胞面臨眾多問題，如早期分化過程中生殖細胞命運的確定，減數(shù)分裂的起始和完成，卵泡結(jié)構(gòu)的成熟等。卵細胞發(fā)育過程中，初級卵泡階段會發(fā)生卵細胞第一次減數(shù)分裂停滯的恢復(fù)，此時卵細胞與顆粒細胞之間的相互作用較之前會顯著增強，這些變化對于卵細胞后期的發(fā)育成熟極為重要［20］。因此，建立報告系統(tǒng)，有效地指示出分化到初級卵泡及其之后時期的細胞對于最終獲得成熟卵細胞的研究很有意義。

本研究采用不同片段長度的人ZP2啟動子與綠色熒光蛋白eGFP構(gòu)建ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP兩個報告系統(tǒng)，一般認為基因的啟動子越長越利于保持其表達的時空特異性，片段過短會丟失某些關(guān)鍵調(diào)控元件，但較長的片段整合入基因組的效率較低，同樣對報告系統(tǒng)的指示作用造成影響。從

圖4 經(jīng)顯微注射人ZP2報告載體的小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)和熒光觀察結(jié)果

3 討論

體外分化培養(yǎng)干細胞得到成熟生殖細胞具有重要的科學(xué)價值和臨床意義，但成熟生殖細胞的形成需要進行減數(shù)分裂，其外觀和功能都發(fā)生了重大變化。因此，此類研究多年來一直是干細胞研究領(lǐng)域WI38細胞核未分化的胚胎干細胞H9的實驗看，這兩種不同長度的啟動子都不會啟動熒光報告基因在這些細胞中的表達。而顯微注射和熒光觀察的結(jié)果表明，ZP2-2500-eGFP報告系統(tǒng)可特異啟動熒光報告基因在小鼠卵母細胞中的表達，可作為一種有效的工具應(yīng)用于胚胎干細胞向卵母細胞分化的研究中。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP兩個報告系統(tǒng)，通過在WI38細胞、未分化的H9細胞核小鼠卵母細胞中的驗證，發(fā)現(xiàn)ZP2-2500-eGFP報告系統(tǒng)可以特異啟動熒光報告基因在卵母細胞中的表達，而在其他細胞系中無報告熒光表達。

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