姜超 蘇小琴 張學(xué)文 潘映紅

點(diǎn)雜交是一種快速檢測(cè)DNA、RNA和蛋白等生物分子種類和含量的簡(jiǎn)便方法，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫遺傳學(xué)和醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域［1-3］。在點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中，先將樣品點(diǎn)到介質(zhì)上，然后用特異性探針進(jìn)行雜交，最終依據(jù)檢測(cè)到的雜交信號(hào)強(qiáng)弱判斷樣品中目標(biāo)物的種類和含量。目前高通量和自動(dòng)化的基因和蛋白芯片技術(shù)已成為高效、快速和大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段［4］，但芯片技術(shù)并不適合普通實(shí)驗(yàn)室使用，手工點(diǎn)雜交仍然是最常使用的點(diǎn)雜交技術(shù)。手工點(diǎn)雜交常用的雜交膜有NC膜、PVDF膜和尼龍膜，這類膜在實(shí)際使用時(shí)普遍存在點(diǎn)樣點(diǎn)排列不整齊、上樣體積受限制、單位面積樣品數(shù)量較少、樣品在雜交膜上容易擴(kuò)散導(dǎo)致點(diǎn)樣點(diǎn)的大小和形狀不一致等問題［5，6］，限制了該技術(shù)的應(yīng)用，有必要對(duì)點(diǎn)樣環(huán)節(jié)加以改進(jìn)。本研究針對(duì)手工點(diǎn)樣斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中存在的樣品點(diǎn)密度小、點(diǎn)樣體積受限制和點(diǎn)樣點(diǎn)不規(guī)整等問題，通過對(duì)雜交膜的預(yù)處理，使樣品富集和吸附在點(diǎn)樣點(diǎn)部位，以期提高手工點(diǎn)樣的通量和規(guī)范性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料和試劑 水稻、小麥和大豆均為常規(guī)品種，葉片采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)溫室，-80℃保存待用。鼠抗水稻看家蛋白抗體Anti-HSP購自北京華大蛋白公司；IRDye800標(biāo)記的山羊抗鼠抗體購自寶生物工程有限公司。硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）和聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）均為頗爾公司產(chǎn)品。低熔點(diǎn)石蠟（48-50℃）和其他試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.1.2 主要儀器 Odyssey CLX雙色紅外熒光成像儀為美國LI-COR公司產(chǎn)品。

1.1.3 緩沖液 提取液：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％（W/V）CHAPS，2μg/μL DTT。洗脫液：0.01mol TBST ：10mmol Tris，100mmol NaCl，用 0.1mol HCl調(diào)pH為7.5，加入0.1％ Tween-20。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取方法 蛋白質(zhì)提取參考Herman等［7］方法改進(jìn)。植物葉片液氮研磨，取0.2 g溶于1.5mL提取液，置于冰上靜置1h；離心（12000×g，4℃，15min），上清液重復(fù)離心后加4倍體積預(yù)冷丙酮，-20℃放置過夜；離心（12000×g，4℃，15min），沉淀即為蛋白提取物。蛋白定量參照Bradford方法［8］。

1.2.2 膜預(yù)處理方法 根據(jù)預(yù)設(shè)點(diǎn)樣點(diǎn)的孔徑、排列方式和密度，先制作塑料材質(zhì)的柱狀凸起模具。制作模具時(shí)需保證柱狀凸起的直徑和間距與預(yù)設(shè)點(diǎn)樣點(diǎn)對(duì)應(yīng)，且凸起部位平整。還可使用底面平整的V型底384孔深孔板等商品化的塑料孔板，以孔板的V型底作為模具的柱狀凸起部位。預(yù)處理雜交膜前，將模具平放在用支撐平板托起的雜交膜上，再用固定夾固定模具和支撐平板，使模具的凸起部位與雜交膜緊密接觸。然后將熔化的石蠟涂布于膜上非模具接觸部位，待石蠟?zāi)毯笮⌒囊谱吣＞?，確保預(yù)留的點(diǎn)樣點(diǎn)無蠟質(zhì)污染，同時(shí)使非點(diǎn)樣部位具有疏水性。

1.2.3 點(diǎn)雜交方法 點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)參考Cheley等［9］方法，封閉和抗體孵育后用洗脫液清洗3次，每次10min。

1.2.4 檢測(cè)方法 用LI-COR Odyssey CLX雙色紅外熒光成像儀直接掃描成像，選擇800nm綠光通道，膜成像分辨率設(shè)置為80 μm。

2 結(jié)果

2.1 雜交膜的預(yù)處理

圖1 預(yù)處理后的雜交膜

點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)常用的雜交膜是NC膜和PVDF膜，這兩種雜交膜均可以用柱狀凸起模具和低熔點(diǎn)石蠟進(jìn)行預(yù)處理。圖1為采用孔距4.5 mm，凸起部位直徑1.2-2.4 mm的模具制備的預(yù)處理雜交膜，膜上淺色部分是保留了雜交膜原有特性的點(diǎn)樣孔，深色部分則為被石蠟覆蓋的疏水區(qū)域。經(jīng)過預(yù)處理的雜交膜的點(diǎn)樣點(diǎn)位置、大小和形狀規(guī)范統(tǒng)一，使用時(shí)可根據(jù)需要選擇不同孔徑的膜。

2.2 預(yù)處理膜的特性

將熒光染料IRDye800標(biāo)記的山羊抗鼠抗體直接點(diǎn)在普通PVDF膜和經(jīng)預(yù)處理的PVDF膜上，待膜干后用Odyssey CLX成像儀檢測(cè)。結(jié)果（圖2）顯示，經(jīng)過預(yù)處理的膜上樣品點(diǎn)形狀整齊規(guī)范，且隨著點(diǎn)樣體積的增加熒光信號(hào)增強(qiáng)，而普通雜交膜上樣品點(diǎn)大小明顯隨點(diǎn)樣體積變化，并呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀。

圖2 預(yù)處理膜（A）和常規(guī)膜（B）手工點(diǎn)樣結(jié)果的比較

2.3 蛋白質(zhì)樣品的制備

采用尿素硫脲法進(jìn)行了水稻、小麥和大豆葉片蛋白質(zhì)樣品制備，SDS-PAGE分析（圖3）顯示蛋白質(zhì)提取物條帶多，得率高。結(jié)果說明，尿素硫脲法提取的3種植物葉片蛋白較完整，可以用于點(diǎn)雜交預(yù)處理膜的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖3 水稻、小麥和大豆葉片全蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 預(yù)處理膜的應(yīng)用

將多次提取的水稻、小麥和大豆蛋白分別點(diǎn)在經(jīng)過預(yù)處理的NC膜和PVDF膜上，與水稻看家蛋白抗體Anti-HSP雜交，結(jié)果（圖4）顯示在預(yù)處理PVDF膜上的水稻和小麥點(diǎn)樣點(diǎn)均有較強(qiáng)信號(hào)，而在預(yù)處理NC膜的雜交信號(hào)較弱，其中大豆的信號(hào)幾乎檢測(cè)不到。

圖4 水稻、小麥和大豆葉片蛋白與Anti-HSP的預(yù)處理膜點(diǎn)雜交

3 討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道的手工點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)普遍存在通量低和可視性較差等問題［5，6］，主要原因是樣品在雜交膜上容易擴(kuò)散和難以保證點(diǎn)樣點(diǎn)規(guī)整一致?；谧詣?dòng)點(diǎn)樣和掃描技術(shù)的高通量芯片分析技術(shù)解決了上述問題，在生物學(xué)和醫(yī)藥研究中發(fā)揮著重要的作用［10-13］，但芯片技術(shù)在便捷性和成本方面并無優(yōu)勢(shì)可言。

利用模具和石蠟對(duì)NC膜和PVDF膜進(jìn)行預(yù)處理，使膜上除點(diǎn)樣點(diǎn)外的區(qū)域具有疏水性，確保樣品富集和吸附在點(diǎn)樣部位，避免了手工點(diǎn)樣時(shí)樣品容易擴(kuò)散和點(diǎn)樣點(diǎn)不統(tǒng)一規(guī)范等問題。模具的孔徑和孔間距可依據(jù)實(shí)際需要調(diào)整，以制備15×20cm的預(yù)處理膜為例，采用孔距4.5 mm，孔徑2.4 mm的柱狀凸起模具，可得到1452個(gè)點(diǎn)樣孔，若孔距3.0 mm，孔徑1.0 mm，則可制作出有3 300個(gè)點(diǎn)樣孔的膜。采用更簡(jiǎn)單的方法，即使用底面平整的V底384孔深孔板做模具，則在7×14cm的膜上可點(diǎn)384個(gè)樣品。需要注意的是，石蠟加熱熔化后，宜保持石蠟液體的溫度高于熔點(diǎn)5℃左右，溫度太高或太低均可能導(dǎo)致處理失敗。涂布石蠟液時(shí)，還必須確保模具和膜的緊密接觸，防止石蠟液滲入模具凸起部位和雜交膜之間。雜交膜經(jīng)預(yù)處理后，僅在點(diǎn)樣部位保留了雜交膜原有特性，可根據(jù)樣品數(shù)裁剪所需要的預(yù)處理膜，實(shí)驗(yàn)成本低廉，操作簡(jiǎn)便。

直接點(diǎn)樣檢測(cè)和實(shí)際樣品的點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證明，使用預(yù)處理NC膜和PVDF膜能保證點(diǎn)樣點(diǎn)的位置、大小和形狀統(tǒng)一規(guī)范，還能增加點(diǎn)樣密度和點(diǎn)樣體積。提取水稻、小麥和大豆葉片全蛋白進(jìn)行的點(diǎn)雜交驗(yàn)證中，重復(fù)樣品在預(yù)處理NC膜和PVDF膜上均得到類似的結(jié)果，其中水稻和小麥點(diǎn)樣點(diǎn)的信號(hào)明顯強(qiáng)于大豆信號(hào)，說明這種改進(jìn)的手工點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)流程可用于實(shí)際樣品分析。驗(yàn)證結(jié)果還顯示，經(jīng)預(yù)處理的NC膜與普通膜的蛋白結(jié)合特性相似，檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低。

4 結(jié)論

通過柱狀凸起模具限定點(diǎn)樣點(diǎn)的大小、排列方式和密度，利用石蠟的疏水特性防止非點(diǎn)樣部位吸附樣品，使預(yù)處理雜交膜的后續(xù)使用更方便。利用本方法獲得的預(yù)處理雜交膜適用于手工點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，為解決點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)過程中存在的問題提供了新的選擇。

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