袁中華， 譚艷美， 陶 媛， 汪江波， 郭東銘， 王 佐， 唐朝克， 田國平，2△

(南華大學1心血管病研究所，動脈硬化學湖南省重點實驗室，2附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽421001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是心腦血管疾病形成的主要原因之一，關于其發(fā)病機制的研究目前主要集中在脂質侵潤學說和損傷反應學說。1999年，Ross［1］在損傷反應學說基礎上明確提出As是一類由炎癥引起的疾病，它是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發(fā)展的全過程始終伴隨著炎癥反應。

脂肪分化相關蛋白(adipose differentiation-related protein，adipophilin)，是脂滴周圍蛋白PAT家族的成員之一。Jiang等［2］在1992年利用差別雜交篩選技術在脂肪細胞中分離提取到adipophilin這種蛋白，在之后的研究中發(fā)現它與脂肪代謝有關。研究發(fā)現，adipophlin不僅可促進細胞內脂質的蓄積，加速As的發(fā)生發(fā)展，而且近期也有研究表明，adipophilin還可影響炎癥因子白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達［3］，但其具體機制并未闡明。此外，adipophlin可通過活化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)影響細胞中脂質蓄積［4］，外界刺激激活ERK1/2磷酸化后，會引起核轉錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)的活化［5］，而 AP-1 與炎癥反應和組織損傷也密切相關。因此，本實驗以此為切入點，探討adipophilin影響炎癥因子表達的具體機制，以及在這個過程中ERK1/2和AP-1所發(fā)揮的可能作用。

材料和方法

1 材料與試劑

RAW264.7細胞購自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco;小牛血清購于杭州四季春生物科技公司;IL-6、TNF-α和MCP-1酶聯免疫分析試劑盒購于XS;無內毒素質粒小劑量快速提取試劑盒和無內毒素質粒大量快速提取試劑盒購于Omega;預染蛋白質分子量標準和EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ、HindⅢ內切酶購于 BioLabs;PD98059和curcumin購于Promega;鼠抗人IL-6、MCP-1、TNF-α、ERK1/2、p-ERK1/2、AP-1 和 p-AP-1的I抗購于 ABZOOM;β-actin的 I抗購于 Proteintech，其它試劑均為進口或國產分析純。主要儀器有Labconco的單蒸水機和去離子水機;Labnet的PCR儀;Nikon的倒置式生物顯微鏡(UX620H);Eppendorf的臺式多功能高速冷凍離心機(5804R型);Bio-Tek的酶標儀(ELx800型)。

2 細胞培養(yǎng)和實驗分組

在10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基中放入PA317細胞，并在10%小牛血清的高糖培養(yǎng)基中放入RAW264.7細胞，放置在濕度為95%，溫度為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。再加入10 mmol/L的HEPES于培養(yǎng)液中。細胞貼壁達90%時傳代。傳代時棄去培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，加5 mL血清培養(yǎng)液，每24～72 h傳代1次。

本實驗共分5組:對照(control，Con)組，未經處理的RAW264.7細胞;表達對照(Adi-Con)組，感染pQCXIP包裝病毒的 RAW264.7細胞;高表達 adipophilin(Adi)組，感染pQCXIP-HA-Adi包裝病毒的RAW264.7細胞;siRNA對照(siRNA-Con)組，感染pSUPER-retro-scramble-siRNA包裝病毒的RAW264.7細胞;adipophilin siRNA(Adi siRNA)組，感染 pSUPER-retro-Adi-siRNA包裝病毒的RAW264.7細胞。

3 方法

3.1 pQCXIP-HA-Adi和 pSUPER-retro-Adi-siRNA 表達載體的轉化、鑒定和提取 根據分子克隆中CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細胞，用本課題組袁中華教授已構建成功的 PQCXIP、PQCXIP-HA-Adi、pSUPER-scramble-siRNA和pSUPER-Adi-siRNA逆轉錄病毒載體，分別加入預冷的DH5α感受態(tài)細胞中，震蕩混勻，利用 E.Z.N.A.?Endo-free Plasmid Mini Kit II進行質粒提取，對提取的質粒進行酶切(EcoRⅠ或NotⅠ)鑒定，使用 E.Z.N.A.?FastFilter Plasmid Maxi Kit對已鑒定的菌液進行質粒提取。

3.2 轉染 pQCXIP-HA-Adi和 pSUPER-retro-AdisiRNA入PA317包裝細胞以及重組DNA逆轉錄病毒液的收集 轉染的前1 d將PA317包裝細胞系按照每孔4×105接種在6孔板中，次日細胞轉染時可達到95%匯片。將pQCXIP和pQCXIP-HA-Adi用無血清高糖培養(yǎng)基和Attractene稀釋，并與DNA稀釋液混勻，室溫下孵育。然后，用無血清的培養(yǎng)基漂洗PA317細胞，每孔的包裝細胞上再加入Attractene/DNA混合物，混勻，室溫下10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后用嘌呤霉素篩選，每2～3 d換1次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)3～4周，獲得穩(wěn)定轉染并持續(xù)表達adipophilin的抗性克隆，將細胞克隆進行轉移和擴增，收集含有病毒的培養(yǎng)液。

3.3 病毒感染RAW264.7細胞 將PA317細胞以每孔4×104細胞接種在24孔板中，次日將嘌呤霉素按不同濃度加入各孔中，每隔2～3 d換液1次，保持嘌呤霉素濃度不變，觀察細胞。挑取嘌呤霉素的濃度為該培養(yǎng)的條件下細胞5 d內的大量死亡，第14天時全部死亡的最低濃度，確定PA317細胞最佳嘌呤霉素篩選濃度。接著，將RAW264.7細胞按照4×105接種到6孔板中，細胞培養(yǎng)箱過夜后分別以10－2、10－3、10－4倍稀釋 pQCXIP 和 pQCXIP-HA-Adi病毒上清，再加入嘌呤霉素終濃度為8 mg/L，混勻。將RAW264.7細胞中的培養(yǎng)基棄去，各孔中加入病毒稀釋液，每種病毒分2孔，感染至少6 h后，用含血清培養(yǎng)基逐步稀釋嘌呤霉素濃度，持續(xù)培養(yǎng)2周，可見陽性的細胞克隆生長。

3.4 蛋白免疫印跡分析 將所需細胞處理后，裂解液裂解細胞，提取總蛋白。利用蛋白定量試劑盒定量后。使蛋白變性，將10%SDS-PAGE膠每孔加入10 μL 樣本，110 V，40 min;之后切膠轉移到 PVDF 膜上，200 mA，1 h;5%無抗脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠源性I抗，置于空氣浴搖床4 h，辣根過氧化物酶標記II抗置于空氣浴搖床50 min。暗室壓片，顯影。

3.5 酶聯免疫吸附實驗 收集各組細胞上清液，用雙抗體夾心法測定MCP-1、TNF-α和IL-6細胞水平，用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加MCP-1、TNF-α和IL-6細胞上清液再與 HRP標記的 MCP-1、TNF-α和 IL-6抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。按照說明書中方法計算，最后統(tǒng)計結果。

4 統(tǒng)計學處理

實驗所得數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，各實驗組均與對照組比較，采用t檢驗，由GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Adipophilin對 IL-6、TNF-α和MCP-1表達的影響

與對照組(Con)相比，高表達adipophilin(Adi)組的IL-6、TNF-α和 MCP-1濃度明顯升高，差別顯著;低表達 adipophilin(Adi-siRNA)組的 IL-6、TNF-α和MCP-1濃度明顯降低，差別顯著;而表達對照(Adi-Con)組和siRNA對照(siRNA-Con)組的IL-6、TNF-α和MCP-1濃度沒有明顯變化，見圖1。

Figure 1.The effects of adipophilin(Adi)on the concentrations of IL-6，TNF-α and MCP-1.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖1 Adipophilin對 IL-6、TNF-α和MCP-1濃度的影響

2 Adipophilin對AP-1蛋白活性的影響

與Con組相比，Adi組的p-AP-1占其總蛋白的比值明顯增高，差別有統(tǒng)計學意義，表明被活化的AP-1增加。Adi-siRNA組的p-AP-1占其總蛋白的比值明顯下調，表明AP-1的活性被抑制。而Adi-Con組和siRNA-Con組p-AP-1占其總蛋白的比值沒有明顯變化，見圖2。

3 Adipophilin對ERK1/2蛋白活性的影響

與Con組相比，Adi組p-ERK1/2占其總蛋白的比值增高，差別有統(tǒng)計學意義，表明被活化的ERK1/2增加;Adi-siRNA組p-ERK1/2占其總蛋白的比值下調，而Adi-Con組和siRNA-Con組沒有明顯變化，見圖3。

4 ERK1/2抑制劑對adipophilin和AP-1蛋白水平的影響

將各組細胞培養(yǎng)48 h，待細胞約鋪滿95%以上，加入50 μmol/L ERK1/2阻斷劑PD98059孵育2 h，收集各組細胞提取總蛋白，Western blot檢測ERK1/2、p-ERK1/2、AP-1、p-AP-1 和 adipophilin 的蛋白水平。統(tǒng)計結果表明，用PD98059處理后，與Con組相比，其它各組中adipophilin蛋白表達均增高;Adi組和Adi-siRNA組的p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值下降，差別有統(tǒng)計學意義;而p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值在Adi-Con組和siRNA-Con組沒有明顯變化，見圖4。

Figure 2.The effects of adipophilin(Adi)on the protein levels of AP-1 and p-AP-1.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control(Con)group.圖2 Adipophilin對AP-1及p-AP-1蛋白水平的影響

5 AP-1抑制劑對adipophilin、ERK1/2及炎癥因子表達的影響

將各組細胞培養(yǎng)48 h，待細胞約鋪滿95%以上，加入20 μmol/L AP-1阻斷劑curcumin孵育2 h，提取各組總蛋白并收集細胞上清液。Western blot檢測adipophilin、AP-1、p-AP-1、ERK1/2 和 p-ERK1/2 的蛋白水平，ELISA方法檢測炎癥因子在上清液的濃度變化。Western blot結果表明，p-AP-1占其總蛋白的比值在各組中均降低。與Con組相比，adipophilin和p-ERK1/2蛋白在Adi組中表達增高，差異有統(tǒng)計學意義，其它蛋白變化不明顯。ELISA結果顯示，與Con組相比，IL-6、TNF-α 和 MCP-1的濃度在 Adi組和Adi-siRNA組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義;Adi-Con組和siRNA-Con組無明顯變化，但與未加入AP-1抑制劑相比，加入AP-1抑制劑各組中炎癥因子濃度明顯降低，見圖5、6。

討 論

Adipophilin是一種不完全包被蛋白，在正常的狀態(tài)下，它主要位于細胞內的新生脂滴周圍，在許多細胞株上都有表達，但在組織水平只在少數細胞有表達。國內外研究證明，adipophilin與泡沫細胞的形成密切相關［6－7］，且在 As發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其具體機制還不是很明確。

Figure 3.The effects of adipophilin(Adi)on the protein levels of ERK1/2 and p-ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control(Con)group.圖3 Adipophilin對 ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平的影響

ERK1/2是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中重要的一員，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫等磷酸化而激活，進入細胞核作用于c-Jun、NF-κB和AP-1等轉錄因子，促進某些基因的轉錄和表達，與細胞的增殖分化密切相關。此外，新近研究發(fā)現，ERK1/2還介導應激和炎癥反應。ERK1/2是MAPK家族中一條重要的信號轉導通路，有研究顯示ERK1/2與動脈粥樣硬化密切相關［8］。本課題組前期研究發(fā)現，在RAW264.7細胞中，氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)以時間依賴方式活化ERK1/2，并調控了adipophilin表達，且與細胞中脂質蓄積相關［4］，在巨噬細胞中，oxLDL誘導 ERK1/2磷酸化［9］，使單核巨噬細胞黏附到內皮細胞，促進動脈粥樣硬化發(fā)展［10］。

Figure 4.The effects of ERK1/2 inhibitor on the protein levels of adipophilin(Adi)，AP-1 and ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖4 ERK1/2抑制劑對adipophilin、AP-1和ERK1/2蛋白水平的影響

Figure 5.The effects of AP-1 inhibitor on the protein levels of adipophilin(Adi)，AP-1 and ERK1/2.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖5 AP-1抑制劑對adipophilin、AP-1和ERK1/2的蛋白水平的影響

Figure 6.The effects of AP-1 inhibitor on the concentrations of IL-6，TNF-α and MCP-1.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control(Con)group.圖6 AP-1抑制劑對IL-6、TNF-α和MCP-1濃度的影響

AP-1是一類重要的真核細胞轉錄因子，是由c-Jun和c-Fos組成的異源二聚體，正常情況下無活性或活性很低，可被各種刺激激活，它的活性失調與炎癥、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。AP-1是ERK1/2重要下游靶信號分子，外界刺激激活ERK1/2磷酸化常常導致核轉錄因子AP-1、NF-κB等活化。

近年來，有關As炎癥反應機制的研究日漸增多，本課題組前期的研究多集中于adipophilin在As脂質蓄積中的作用，然而，Chen等［3］研究發(fā)現，在THP-1巨噬細胞中adipophilin可增加炎癥因子表達，這一現象為我們提供了一個新的研究方向，因此本實驗即致力于研究adipophilin影響炎癥因子表達的機制。

為了進一步驗證Chen等的實驗結果，我們首先構建了穩(wěn)定高表達和沉默adipophilin的RAW264.7細胞株，觀察了不同adipophilin表達狀態(tài)下細胞中炎癥因子的變化。實驗結果表明，在RAW264.7細胞中，隨著 adipophilin的表達上調炎癥因子 IL-6、TNF-α和MCP-1的濃度明顯上升，尤其是TNF-α上調更明顯;而沉默adipophilin使IL-6、TNF-α和MCP-1的濃度明顯下降。說明adipophilin可以影響炎癥因子IL-6、TNF-α和 MCP-1表達，與Chen等的實驗結果相吻合。但adipophilin是通過什么途徑影響炎癥因子IL-6、TNF-α和MCP-1表達，這其中的機制我們還不清楚。

ERK1/2在動脈粥樣硬化中具有重要的作用，有研究表明許多促炎基因表達都受到ERK1/2的調節(jié)。Liu等［4］也已證實，在巨噬細胞脂質蓄積中，ERK1/2和adipophilin有關。此外，AP-1是ERK1/2重要下游靶分子，p-ERK1/2可活化AP-1，在人體主動脈平滑肌細胞中，轉錄因子AP-1經ERK1/2激活，調節(jié)基質金屬蛋白酶9的表達［5］。有報道顯示［11］，oxLDL、乙?；兔芏戎鞍椎韧饨缫蛩氐拇碳ぜせ盍薓APK，MAPK的激活促使轉錄因子如NF-κB、AP-1、P53等的活化并加重了炎癥反應。這些證據顯示，ERK1/2調控 adipophilin表達，而 ERK1/2可激活轉錄因子AP-1進一步調節(jié)炎癥因子表達，我們推測adipophilin影響炎癥因子表達，可能是通過ERK1/2-AP-1途徑。

實驗結果提示，在 adipophilin表達增高時ERK1/2和AP-1兩者的活性形式 p-ERK1/2和p-AP-1的水平明顯增高，沉默adipophilin時p-ERK1/2和p-AP-1占其總蛋白的比值也明顯降低，說明ERK1/2和AP-1可以被adipophilin調控。參考文獻［12-14］，用ERK1/2抑制劑 PD98059的最佳使用濃度50 μmol/L預處理細胞2 h，p-ERK1/2及p-AP-1占其總蛋白的比值明顯下調，這可能是ERK1/2參與AP-1表達的調控。隨后用AP-1抑制劑curcumin(20 μmol/L)預處理細胞2 h，Adi組中 adipophilin 和p-ERK1/2蛋白水平增高，但p-AP-1占其總蛋白的比值明顯降低，此外我們還發(fā)現炎癥因子IL-6、TNF-α和MCP-1在細胞上清液的濃度明顯下調。這提示ERK1/2-AP-1途徑調節(jié)了炎癥因子表達。

已有的ERK1/2和AP-1的相關實驗顯示，激活ERK1/2、JNK、p38 MAPK 和 JAK-STAT信號，顯著增加了膀胱癌細胞中AP-1和ERK1/2的結合活性［15］。低鹽可通過促進ERK1/2磷酸化、增加AP-1等信號的轉導來實現細胞環(huán)氧化酶2的表達增加［16］。結合我們的實驗，可以認為，adipophilin對炎癥因子影響，首先通過激活 ERK1/2，ERK1/2在轉錄水平活化AP-1，進而調控炎癥因子的表達。本實驗結果為證實adipophilin在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起到的作用提供了有力的實驗依據。

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