尹柏雙　王秋竹　付連軍等

摘要： 為研究不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病情況與乳清中C-反應(yīng)蛋白（CRP）含量變化的關(guān)系，選取6頭健康奶牛和18頭患輕、中、重度隱性乳房炎奶牛，采集乳樣，分離乳清，利用Elisa CRP檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中CRP含量。結(jié)果表明，隨著隱性乳房炎病情加重、乳汁體細(xì)胞數(shù)的增加，乳清中CRP含量逐漸升高，與健康對(duì)照組比較升高極顯著。結(jié)果表明，乳清中CRP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，乳腺損傷程度與乳汁體細(xì)胞數(shù)增加和乳清中CRP含量呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞： 隱性乳房炎；奶牛；乳清；C-反應(yīng)蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：S858 237 2+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0214-02

奶牛隱性乳房炎引起泌乳奶牛產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，養(yǎng)殖成本增加，產(chǎn)后發(fā)情延長(zhǎng)，妊娠時(shí)間推遲，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一 [1]。C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP） 是一種由IL-1、IL-6、TNF-α刺激下肝細(xì)胞和局部炎癥巨噬細(xì)胞合成的急性反應(yīng)蛋白 [2]。CRP不僅可以與侵入的細(xì)菌、真菌細(xì)胞壁上的磷酸膽堿結(jié)合，激活補(bǔ)體，促使內(nèi)源性或外源性配體物質(zhì)清除等功能 [3]；還具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)各種細(xì)菌和異物的吞噬能力 [4]，從而發(fā)揮抗炎作用 [5]。研究發(fā)現(xiàn)，CRP在細(xì)菌感染性腦膜炎、心血管疾病、心房顫動(dòng)、冠心病和妊娠糖尿病等疾病診斷中具有重要意義 [6-10]。C-反應(yīng)蛋白作為一個(gè)新的診斷細(xì)菌性感染的細(xì)胞因子指標(biāo)，在感染性疾病的診斷中發(fā)揮重要作用 [11]。大多數(shù)奶牛隱性乳房炎是由鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌等細(xì)菌感染引起的一種疾病，伴發(fā)炎癥反應(yīng)、乳腺局部病變等臨床癥狀，而奶牛隱性乳房炎發(fā)病與C-反應(yīng)蛋白的相關(guān)性報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究乳清中C-反應(yīng)蛋白與不同程度奶牛隱性乳房炎發(fā)病的關(guān)系，為隱性乳房炎快速診斷方法的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1 1 試驗(yàn)動(dòng)物

通過(guò)乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后選擇年齡、胎次、產(chǎn)奶量、泌乳期等指標(biāo)相近的健康奶牛6頭和患不同程度奶牛隱性乳房炎奶牛18頭，奶牛由吉林市某奶牛場(chǎng)提供。

1 2 主要試劑與儀器

C-反應(yīng)蛋白（CRP）測(cè)定試劑盒（南京建成生物試劑研究所）；Fossmatic 5000體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FOSS 公司，丹麥）；Varioskan 酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）；離心機(jī)（Sigma公司，美國(guó)）。

1 3 試驗(yàn)動(dòng)物分組

通過(guò)乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)后將試驗(yàn)?zāi)膛７殖山】祵?duì)照組（6頭，乳中體細(xì)胞數(shù)（SCC）≤10萬(wàn)個(gè)/mL）、輕度隱性乳房炎組（6頭，50×104 mL500萬(wàn)個(gè)/mL）。

1 4 乳樣采集

采集試驗(yàn)?zāi)膛５娜橹?，采樣前?duì)乳區(qū)進(jìn)行清洗，然后用70%的乙醇消毒乳區(qū)，棄掉頭3 把乳汁，分別采乳10 mL裝入無(wú)菌試管中，將采集的乳樣放到冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1 5 乳清制備

將采集的乳樣于3 000 r/min離心5 min，除去上層乳脂，然后于16 000 r/min高速離心機(jī)中離心10 min，去除沉淀，保留上清，4 ℃保存，待測(cè)。

1 6 檢測(cè)方法

乳汁體細(xì)胞計(jì)數(shù)采用體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定，C-反應(yīng)蛋白（CRP）含量采用CRP Elisa試劑盒測(cè)定，在酶標(biāo)儀上比色測(cè)定D450 nm，根據(jù)試劑盒說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算CRP含量。

1 7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17 0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)做單因素方差分析，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，分析樣品間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

患輕度乳房炎奶牛乳清中CRP含量為（49 01±9 46 ）μg/mL，與健康對(duì)照組比較升高極顯著；患中、重度乳房炎奶牛乳清中CRP含量較健康對(duì)照組極顯著升高（表1）。隨著乳房炎病情加重，乳汁體細(xì)胞數(shù)增加，乳清中CRP含量逐漸升高，表明乳腺損傷程度和乳汁體細(xì)胞數(shù)增加與乳清中CRP含量呈正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

急性期蛋白是機(jī)體受感染、炎癥等應(yīng)激原刺激下所產(chǎn)生

變化的蛋白，又叫應(yīng)激敏感蛋白質(zhì)，C-反應(yīng)蛋白是急性期蛋白成員之一。CRP是由以非共價(jià)對(duì)稱(chēng)連接完全相同的5個(gè)單體組成，分子量約為118 ku [12]。CRP 通過(guò)結(jié)合具有磷酸基的物質(zhì)，來(lái)識(shí)別各種病原體和機(jī)體受傷或壞死的細(xì)胞膜，具有推動(dòng)組織修復(fù)和再生的功能；細(xì)菌感染后，CRP 能與病原體結(jié)合，激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑，清除異物，殺死病原微生物 [13-14]。安芳蘭等研究表明，血清中急性期蛋白的濃度變化可為疾病診斷、預(yù)防提供可靠的依據(jù) [15]。伍濤等研究表明，C-反應(yīng)蛋白在奶牛乳房受到病理?yè)p傷時(shí)，具有較高的敏感性，當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時(shí)，可以通過(guò)測(cè)定其血清和乳汁中C-反應(yīng)蛋白水平，監(jiān)測(cè)乳房組織的炎癥狀態(tài) [16]。楊洪森報(bào)道，家兔乳頭管灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后引起家兔乳腺上皮細(xì)胞排列改變，腺泡腔擴(kuò)張顯著、腔內(nèi)分泌物增加，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或崩解，間質(zhì)小靜脈和毛細(xì)血管充血，血清中CRP含量顯著升高 [17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，患隱性乳房炎奶牛乳清中CRP含量極顯著高于健康對(duì)照組，隨著隱性乳房炎病情加劇乳汁中CRP含量逐漸升高，與王洪偉報(bào)道的患乳房炎奶牛血清中CRP變化基本一致 [18]。在臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域針對(duì)我國(guó)奶牛隱性高發(fā)病率和診斷技術(shù)相對(duì)落后的情況下，利用乳清中CRP變化的特點(diǎn)，開(kāi)展早期快速診斷將具有廣闊的研究空間和發(fā)展前景。

本研究結(jié)果表明，乳清中CRP含量變化與隱性乳房炎發(fā)病具有一定相關(guān)性，隨著乳腺炎癥加劇和乳汁體細(xì)胞數(shù)增加，乳清中CRP含量顯著升高。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳美玲，付靜濤，王江濤，等 影響奶牛隱性乳房炎發(fā)病率的主要因素[J] 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014，2（4）：49-50

[2]楊永昌，王北寧 C反應(yīng)蛋白的臨床研究進(jìn)展[J] 中國(guó)誤診學(xué)雜志，2007，7（4）：693-695

[3]Thomas L 臨床實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)[M]//呂 元，朱漢民，沈 霞，等譯 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004：677-682

[4]Eisenhardt S U，Thiele J R，Bannasch H，et al C-reactive protein：how conformational changes influence inflammatory properties[J] Cell Cycle，2009，8（23）：3885-3892

[5]Black S，Kushner I，Samols D，et al C-reactive protein[J] Journal of Biological Chemistry，2004，279：48487-48490

[6]李 強(qiáng)，黃月艷，林 娜，等 化膿性腦膜炎患兒血清及腦脊液中C反應(yīng)蛋白變化及臨床意義[J] 中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2005，20（3）：171-172

[7]Zwaka T P，Hombach V，Torzewski J C-reactive protein-mediated low density lipoprotein uptake by macrophages-Implications for atherosclerosis[J] Circulation，2001，103（9）：1194-1197

[8]覃桂林，秦孺子 C反應(yīng)蛋白與心房顫動(dòng)[J] 中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2005，5（4）：613-615

[9]Kinjo K，S A S，Ohnishi Y，et al Impact of high-sensitivity C-reactive protein on predicting long-term mortality of acute myocardial infarction[J] American Journal of Cardiology，2003，91（8）：931-935

[10] 韓 姹，牛秀敏 C反應(yīng)蛋白與妊娠期糖尿病的研究進(jìn)展[J] 國(guó)外醫(yī)學(xué)：婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)，2006，33（1）：20-23

[11]吳少卿，文道林，曹文平 血清降鈣素原和C-反應(yīng)蛋白在細(xì)菌感染性疾病診斷中的意義[J] 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2009，11（4）：66-68

[12]Eckersall P D Acute phase proteins：form，function and analysis[R] American College of Veterinary Pathologists and American Society for Veterinary Clinical Pathology Tucson，Arizona，2006

[13]Mold C，Gewurz H，Clos T W Regulation of complement activation by C-reactive protein[J] Immunopharmacology，1999，42：23-30

[14]伍 濤 乳房炎奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)與主要急性期蛋白和相關(guān)酶的相關(guān)性研究[D] 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：57

[15]安芳蘭，楊保田，董文教，等 急性期蛋白的研究進(jìn)展[J] 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（1）：195-198

[16]伍 濤，劉莉莉，杜然華，等 急性期蛋白及其在奶牛乳房炎發(fā)展中的作用[J] 中國(guó)奶牛，2010，20（3）：30-33

[17]楊洪森 家兔乳房炎模型建立及對(duì)機(jī)體內(nèi)抗氧化指標(biāo)和急性期蛋白表達(dá)的影響[D] 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：45

[18]王洪偉 不同程度奶牛乳腺炎乳中相關(guān)酶與急性蛋白的研究[D] 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：35-36