李軍+李常挺+潘艷等

摘要： 應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)羊種布魯氏菌NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，NN1202和LA1105株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因在布魯氏菌種間高度保守。應(yīng)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域；應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)。對(duì)各方法的結(jié)果綜合分析，OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202區(qū)域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183區(qū)域可能是優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

關(guān)鍵詞： 布魯氏菌；OMP25；OMP31；抗原表位

中圖分類號(hào)： S858.26 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0038-04

布魯氏菌是一種感染人、家畜、野生動(dòng)物等60多種動(dòng)物的人獸共患病原菌，根據(jù)宿主和致病性的差異，分為羊種布魯氏菌（Brucella melitensis）、牛種布魯氏菌（B. abortus）、豬種布魯氏菌（B.suis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B. ovis）、犬種布魯氏菌（B. canis）和沙林鼠種布魯氏菌（B. neotomae）6個(gè)種；此外，還從海洋動(dòng)物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的海豚布魯氏菌（B. cetacease）和海豹布魯氏菌（B. pinnipediae） [1]。在這8種布魯氏菌中，以羊種布魯氏菌對(duì)人的致病性最強(qiáng)。布魯氏菌的外膜由外膜蛋白、脂多糖和磷脂層構(gòu)成。外膜蛋白為一類與毒力密切相關(guān)的免疫原性蛋白 [2-3]，其中，分子量分別為25 ku（OMP25）和31 ku（OMP31）的2種外膜蛋白是布魯氏菌的主要外膜蛋白 [4-5]。OMP25蛋白和OPM31蛋白免疫小鼠后，能分別誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG2a 和IgG1類型的抗體，是一種抗原免疫保護(hù)蛋白 [6-7]。Bowden等證實(shí)OMP31的單克隆抗體與其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體存在競(jìng)爭(zhēng)抑制現(xiàn)象，表明OMP31存在抗原表位 [8]。本研究擬對(duì)廣西分離的2株羊種布魯氏菌NN1202、LA1105菌株的[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)二者的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，為后續(xù)的合成肽疫苗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 羊種布魯氏菌NN1202和LA1105菌株由廣西獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室分離、鑒定和保存 [9]。羊種布氏菌5號(hào)疫苗為PCR擴(kuò)增陽性對(duì)照菌株。

1.1.2 試劑 布氏瓊脂粉購自英國(guó)Oxiod公司；馬血清購自美國(guó)Thermo公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒及PCR反應(yīng)所用試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1OMP25和OMP31 基因的PCR擴(kuò)增和克隆 取保存的羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株凍干菌種，每支菌種加入0.2 mL無菌水溶解，接種棒蘸取菌液接種于含10%馬血清布氏瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72 h。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，以細(xì)菌DNA為模板對(duì)[WTBX][WTBX]OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以羊種布氏菌5號(hào)疫苗為陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃（57 ℃） 1 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增預(yù)期片段分別為650 bp和750 bp。引物序列分別為PM25-F：5′-GAATTCATGCGCACTCTTAAGTCTCTC-3′；OPM25-R：5′-GTCGACTTAGAACTTGTAGCCGATGCC-3′；OPM31 -F：5′-GCGAATTCATGAAGTCCGTAATT-3′；OPM31-R：5′-GCCTCGAGTTAGAACTTGTAGTT-3。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

DNA膠回收試劑盒純化、回收目的片段后，與pMD-18T載體4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定正確的陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 OMP25和OMP31基因的核苷酸同源性分析 應(yīng)用MegAlign軟件對(duì)測(cè)序獲得的OMP25和OMP31基因的核苷酸序列與GenBank上登錄的已知序列進(jìn)行同源性比較，分析它們之間的親緣關(guān)系。

1.2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角區(qū)域和卷曲區(qū)域 [10-11]。

1.2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞抗原表位分析 應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)，綜合各方法的結(jié)果并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）來分析OMP25蛋白和OMP31蛋白的B細(xì)胞抗原表位 [12-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1OMP25和OMP31基因的PCR擴(kuò)增

提取羊種布魯氏菌NN1202株和LA1105株的DNA，分別對(duì)OMP25和OMP31 [STBZ]基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到650 bp和750 bp的擴(kuò)增片段，大小與陽性對(duì)照羊種布魯氏菌5號(hào)疫苗的擴(kuò)增結(jié)果一致（圖1）。

2.2 OMP25和OMP31 基因的核苷酸同源性分析

NN1202株和LA1105株的陽性O(shè)MP25質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為650 bp，內(nèi)含1個(gè)642 bp的開放閱讀框，編碼213個(gè)氨基酸，它們的核苷酸序列已登錄GenBank，登錄號(hào)分別為KJ720202和KJ720201。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，NN1202株和LA1105株OMP25之間的同源性為100%，與羊種布魯氏菌M5-90（CP001852）、豬種布魯氏菌S2（CP006961）、牛種布魯氏菌S19（CP000887）、犬種布魯氏菌ATCC23365（CP000872）、綿羊附睪種ATCC25840（CP000708）的同源性均為100%。

NN1202株和LA1105株的陽性O(shè)MP31 質(zhì)粒測(cè)序后證實(shí)擴(kuò)增片段大小為750 bp，內(nèi)含1個(gè)723 bp的開放閱讀框，編碼240個(gè)氨基酸，它們的核苷酸序列已登錄GenBank，登錄號(hào)分別為KJ720203和KJ720204。將它們的核苷酸序列與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，NN1202株、LA1105株和羊種布魯氏菌M5-90（CP001852）[OMP25 之間的同源性均為100%；與豬種布魯氏菌S2（CP006961）、犬種布魯氏菌ATCC23365（CP000872）、綿羊附睪種ATCC25840（CP000708）的同源性為99%。

2.3 OMP25蛋白和OMP31蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，OMP25蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域（13～29、75～79、100～104、109～114），9個(gè)β-折疊區(qū)域（6～10、49～55、62～67、86～91、130～144、154～159、173～181、190～196、204～207）。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的13個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和11個(gè)卷曲區(qū)域（圖2）。OMP31蛋白有4個(gè)α-螺旋區(qū)域（4～21、121～134、144～145、172～176），9個(gè)β-折疊區(qū)域（22～25、75～77、82～88、97～102、112～115、135～139、147～152、156～163、230～240）。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長(zhǎng)短不一的17個(gè)轉(zhuǎn)角區(qū)域和12個(gè)卷曲區(qū)域（圖3）。

2.4 OMP25蛋白和OMP31蛋白的氨基酸親水性分析

Kyte-Doolittle方法分析表明，OMP25蛋白有較多的親水[CM（25]性區(qū)域（≥0.5），分布較為均勻，主要有27～32、44～46、

2.5 OMP25蛋白和OMP31蛋白的柔性區(qū)域分析

2.6 OMP25蛋白和OMP31蛋白的溶劑表面可及性分析

Emini方法分析表明，59～63、70～75、101～107、177～189和196～202區(qū)域出現(xiàn)在OMP25蛋白溶劑表面可及性較大（≥1）（圖8）。OMP31蛋白的溶劑表面可及性區(qū)域較少，只有2個(gè)區(qū)域（63～69和177～182）（圖9）。

2.7 OMP25蛋白和OMP31蛋白的抗原指數(shù)分析

Jameson-Wolf方法分析表明，OMP25蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域（≥0）有：26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207，以C端區(qū)域的抗原指數(shù)較高，跨度較大，存在抗原表位的可能性也較大（圖10）。OMP31蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域（≥0）分布較均勻，以23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大（圖11）。

2.8 OMP25蛋白和OMP31蛋白B細(xì)胞表位綜合分析

應(yīng)用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結(jié)合B細(xì)胞表位網(wǎng)上預(yù)測(cè)分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202[CM（21*2/3]區(qū)域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、

102～111、125～130、166～173、176～183區(qū)域均具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性，抗原指數(shù)也較高，結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上含有容易形成抗原表位的轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域，因此，這些區(qū)域極有可能是OMP25蛋白和OMP31蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位。

3 討論

研究證實(shí)，布魯氏菌[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因是免疫原性基因，它們編碼的蛋白對(duì)小鼠具有免疫保護(hù)作用 [6-7]。本研究對(duì)羊種NN1202株和LA1105株[WTBX][STBX]OMP25和OMP31 基因核苷酸同源性比較結(jié)果表明，[OMP25和OMP31 基因在布魯氏菌種間高度保守，OMP25和OMP31蛋白可以作為布魯氏菌合成肽疫苗的候選靶蛋白。

利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)病原微生物的抗原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析是研制合成肽疫苗的基礎(chǔ) [16]。研究表明，B細(xì)胞抗原表位的形成取決于蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí)，多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊的氫鍵鍵能高，形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，在蛋白內(nèi)部中起著“骨架”作用，不易與抗體結(jié)合，成為B細(xì)胞抗原表位的幾率低。相反，轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域的氫鍵鍵能低，形成盤旋、扭曲等松散的柔性結(jié)構(gòu)暴露在蛋白表面，與抗體結(jié)合的幾率大，成為B細(xì)胞抗原表位的可能性高 [17]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細(xì)胞抗原表位有密切關(guān)系。

B細(xì)胞抗原表位的分析方法主要有蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析 [10-14]。Jamson等將上述4種方法綜合，以蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計(jì)算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法 [15]。根據(jù)該方法分析，發(fā)現(xiàn)OMP25蛋白的26～33、56～65、68～75、93～99、101～105、117～127、143～156、165～179、183～190、195～207區(qū)域以及OMP31蛋白的23～33、51～75、102～111、118～130、136～147、167～173、177～184和206～227區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構(gòu)象時(shí)，蛋白表面的氨基酸會(huì)遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢(shì)抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，筆者選擇OMP25蛋白的27～34、59～65、69～75、101～107、148～154、182～189、197～202區(qū)域以及OMP31蛋白的25～32、50～58、63～70、102～111、125～130、166～173、176～183區(qū)域作為后續(xù)合成肽疫苗研究的靶位點(diǎn)。

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