賈慧等

摘要： 為研究玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]的功能，采用PCR方法克隆得到[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因3 021 bp的OFR序列，將其插入到含有色氨酸強(qiáng)啟動(dòng)子、GFP和bar基因抗性的質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上構(gòu)建回復(fù)載體pBARKS1-MR-eGFP，通過測(cè)序、雙酶切驗(yàn)證載體構(gòu)建情況。結(jié)果顯示，pBARKS1-MR-eGFP載體構(gòu)建成功，可以進(jìn)行基因回復(fù)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。該結(jié)果為進(jìn)一步確定黑色素合成調(diào)控途徑，進(jìn)而明確黑色素合成調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 玉米大斑病菌；黑色素；調(diào)控基因；[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]

中圖分類號(hào)： S435.131.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0024-03

玉米大斑病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，是我國(guó)冷涼地區(qū)如東北、華北和西南玉米區(qū)重要葉部病害 [1-2]，種植感病品種如遇到流行年份可減產(chǎn)50%以上。例如，2012年受布拉萬臺(tái)風(fēng)的影響，東北地區(qū)潮濕多雨，玉米大斑病大暴發(fā)，平均危害程度3～5級(jí)，嚴(yán)重地塊達(dá)9級(jí)。引起該病害的病原菌屬半知菌突臍蠕孢屬，1876年在意大利首次報(bào)道，其無性態(tài)為玉米大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum），有性態(tài)為玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）。有研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌代謝產(chǎn)生的DHN黑色素是該病菌致病的重要毒力因子，沉積在真菌特化結(jié)構(gòu)、附著在胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，產(chǎn)生機(jī)械壓力突破寄主表皮細(xì)胞，使植物染病 [3]。

DHN黑色素合成途徑至少有聚酮體合成酶、還原酶、脫水酶、氧化酶4類蛋白酶參與。起始于1個(gè)聚酮體合成酶（polyketide synthase），催化醋酸鹽合成1，3，6，8-4THN，經(jīng)還原酶（1，3，6，8-tetra-HN reductase）催化合成小柱孢酮（scytalone），脫水酶（scytalone dehydratase）催化合成1，3，8-THN，還原酶（1，3，8-tetra-HN reductase）催化合成柱孢醌（vermelone），再經(jīng)脫水酶催化合成1，8-DHN，最后經(jīng)氧化酶（laccase）氧化聚合形成1，8-DHN黑色素。另外，該途徑中還存在一種調(diào)控黑色素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子MR [4]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控黑色素合成的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)黑色素合成途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的生成，改變病原菌致病力。水稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]BMR1突變后，菌落顏色變白，過表達(dá)菌株的BMR1[WTBZ][STBZ]表達(dá)量高于野生型的10倍 [5]。葫蘆刺盤孢（Colletotrichum lagenarium）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中Cmr1p和Pig1p是黑色素合成轉(zhuǎn)錄因子，編碼基因[WTBX][STBX]Cmr1和Pig1[WTBZ][STBZ]突變后病原菌的黑色素合成受到影響，回復(fù)突變后，病原菌生長(zhǎng)表型與野生型相似，說明功能回復(fù)到正常水平 [4]。甘藍(lán)鏈格孢（Alternaria brassicicola）黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]Amr1[WTBZ][STBZ]突變后，病原菌菌落顏色變淺，接種白菜葉片發(fā)現(xiàn)致病力較野生型增強(qiáng) [6]。同時(shí)，文獻(xiàn)報(bào)道，絲狀真菌中黑色素合成酶基因缺失或沉默，黑色素合成則會(huì)受到影響，病原菌的致病力也有不同程度的變化 [7]。玉米大斑病菌中聚酮體合成酶基因（StPKS）RNAi的幾株轉(zhuǎn)化子黑色素合成受到不同程度的干擾 [8]；玉米大斑病菌中HN還原酶基因（[WTBX][STBX]3HNR[WTBZ][STBZ]）突變則形成淺褐色突變菌株 [9]；玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）脫水酶基因（[WTBX][STBX]scl1[WTBZ][STBZ]）缺失后形成橙紅色菌落 [10]；條件致病真菌新型隱球酵母菌（Cryptococcus neoformans）氧化酶基因[WTBX][STBX]LAC1缺失后，菌落顏色發(fā)生了變化，而同工酶基因LAC2的轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LAC1[WTBZ][STBZ]基因，該基因缺失后，病原菌黑色素合成速度延遲，合成量并未受到影響 [11]。目前，以抑制黑色素合成過程中從1，3，6，8-四羥基萘到小柱孢酮、1，3，8-三羥基萘到柱孢醌的2步脫氫反應(yīng)的2個(gè)還原酶為靶點(diǎn)開發(fā)的特異性抑制劑——三環(huán)唑（tricyclazole）作為新型殺菌劑防治稻瘟病菌，有良好效果 [12]。本研究室前期克隆到黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]，利用基因敲除技術(shù)獲得了該基因的2株基因缺失突變體，初步分析了突變體的生長(zhǎng)發(fā)育、黑色素合成及致病性等與野生型的差別，初步明確了該基因的功能，發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因缺失后，病原菌生長(zhǎng)速度沒有明顯變化，黑色素含量顯著降低，致病力明顯減弱。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上構(gòu)建[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因回復(fù)載體，從而對(duì)[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因功能及黑色合成調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，以闡明玉米大斑病菌的致病機(jī)制，也可以為研發(fā)新型殺菌劑、探索新的防治途徑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米大斑病菌菌株01-23、pBARKS1-eGFP載體、大腸桿菌（Eschrichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、SDS堿裂解溶液（溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存或配制；UNIQ-10柱式Trizol RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DEPC、DNaseⅠ（RNase free）、RNasin、dNTP Mixture、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶，購自寶生物（大連）有限公司；引物的合成和測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 總RNA的提取

參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書，取經(jīng)PD液體培養(yǎng)基21 ℃、黑暗培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌絲，濾紙吸干，取0.1 g用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入Trizol試劑 1 mL，并用槍頭反復(fù)吹打，室溫放置5～10 min，使核蛋白與核酸完全分離；加入200 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min；吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，加入 1/2 體積無水乙醇，混勻；將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置 2 min，12 000 r/min 離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放入收集管中，加入500 μL RPE Solution，靜置 2 min，10 000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液（檢查RPE Solution是否已經(jīng)按比例加入無水乙醇），此步驟重復(fù)1次；將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min離心2 min，將殘余的乙醇去除；將吸附柱加入干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated ddH2O，靜置5 min，12 000 r/min離心2 min，提取得到RNA樣品溶液，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。配?0%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)得到的總RNA的純度及完整性；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。

1.3 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1 μg模板RNA，1 μL Oligo （dT）12～18 Primer（50 μmol/L），RNase free ddH2O補(bǔ)充至6 μL，70 ℃保溫 10 min 后迅速在冰上急冷2 min以上，離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于微管底部；在該微管中加入5×M-MLV buffer 2 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L） 0.5 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL，RTase M-MLV（RNase H-，200 U/μL）0.25～1 μL，RNase free ddH2O補(bǔ)充至 10 μL；42 ℃保溫1 h，70 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶活性15 min，插冰上冷卻；反應(yīng)合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因ORF序列的獲得

分析 基因序列的酶切位點(diǎn)，根據(jù)載體pBARKS1-eGFP上的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)NotⅠ和SmaⅠ的特異引物MGF、MGR，擴(kuò)增 基因的ORF序列。

擴(kuò)增體系：2 μL模板cDNA，MGF（10 μmol/L）1.0 μL，MGR（10 μmol/L）1.0 μL，2.5 μL 10×Taq buffer（Mg 2+Plus），2 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U），ddH2O 16.2 μL。

擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，61 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸4 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結(jié)果顯示，DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 基因回復(fù)載體的構(gòu)建

將回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pBARKS1-eGFP載體用 SmaⅠ、NotⅠ雙酶切，酶切體系為pBARKS1-eGFP質(zhì)粒DNA 2 μL（PCR回收產(chǎn)物5 μL），SmaⅠ、NotⅠ各1 μL，緩沖液 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL，37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收線性[JP2]質(zhì)粒片段和PCR產(chǎn)物。然后進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL、pBARKS1- eGFP線性質(zhì)粒 1 μL、T4連接酶（350 U/μL）1 μL、10×ligation buffer 1 μL（終濃度為1×），用dd H2O補(bǔ)至10 μL，最適連接溫度為 16 ℃，時(shí)間為1～3 h或過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取白色單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp+）[JP2]中，37 ℃、220 r/min 下振蕩培養(yǎng)5～6 h；取2 μL菌液作模板，利用pBARKS1-eGFP載體上的通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進(jìn)行PCR檢測(cè)；選取PCR檢測(cè)陽性的單克隆測(cè)序；將測(cè)序正確的陽性克隆命名為pBARKS1-MR-eGFP。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米大斑病菌總RNA的提取

利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取PD培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌體的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm/D280 nm=1.98，濃度為35.7 μg/μL，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好、無蛋白質(zhì)、DNA及小分子的污染。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示28S、18S、5S特征條帶清晰（圖1），說明總RNA質(zhì)量較好，無降解，可以用于cDNA第一鏈的合成。

2.2 基因ORF序列的擴(kuò)增

利用 基因序列的酶切位點(diǎn)，結(jié)合載體質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上的多克隆位點(diǎn)，最終選用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SmaⅠ，設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的特異引物，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增 基因ORF序列，得到3 021 bp的條帶，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.3 pBARKS1和pBARKS1-eGFP載體的酶切驗(yàn)證

提取pBARKS1載體質(zhì)粒，用NotⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，得到線性質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示有單一的 4 500 bp 條帶（圖3-A）；提取pBARKS1-eGFP載體質(zhì)粒，用EcoRⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切，得到線性載體pBARKS1和GFP片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示有4 500、720 bp 等2條條帶（圖3-B）。說明pBARKS1-eGFP質(zhì)粒載體正確。

2.4 回復(fù)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物分別和pBARKS1-eGFP用NotⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后將帶有相同黏性末端的PCR產(chǎn)物和線性的pBARKS1-eGFP連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，轉(zhuǎn)化后選擇白色單克隆進(jìn)行菌液檢測(cè)，引物用載體通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果正確，得到pBARKS1-MR-eGFP重組載體（圖4）。載體pBARKS1-MR-eGFP全長(zhǎng)約8 241 bp，NotⅠ與SmaⅠ雙酶切得到大小為5 220、3 021 bp的條帶，結(jié)果均與預(yù)期大小相符（圖5），玉米大斑病菌黑色素調(diào)控基因 的基因回復(fù)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 結(jié)論與討論

目前，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的飛速進(jìn)步，很多絲狀真菌已經(jīng)完成了基因組測(cè)序工作，對(duì)其研究已步入后基因組時(shí)代，分析和確定基因的功能及關(guān)聯(lián)性正成為分子生物學(xué)及遺傳學(xué)研究[CM（25]的熱點(diǎn) [13]。研究真菌基因功能的方法有很多種，如基因敲[CM）]

除/置換（gene knockout ）、RNA干擾（RNA interference，RNAi）、基因標(biāo)記（gene tagging）、基因超表達(dá)（over expression）、體外轉(zhuǎn)座子標(biāo)記（in vitro transposon tagging）、異源表達(dá)（heterologous expression）和酵母雙雜交（yeast two-hybrid system）等?；蚯贸夹g(shù)是一種遺傳工程修飾技術(shù)，某個(gè)基因一旦被確定有研究?jī)r(jià)值，往往最為直接的方式之一就是將其從基因組中敲除或置換，而后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，明確其功能 [14]。該技術(shù)是通過同源重組的方法將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一確定的位置，經(jīng)過外源DNA序列與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組或置換，達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的目的，從而改變細(xì)胞的遺傳特性 [15]。回復(fù)突變（reverse mutation）指基因缺失突變體經(jīng)過第2次突變又完全或部分恢復(fù)為原來的基因型和表現(xiàn)型，基因超表達(dá)指目的基因的全長(zhǎng)序列與高活性組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，通過轉(zhuǎn)化，獲得該基因編碼產(chǎn)物大量積累，這2種技術(shù)的應(yīng)用更豐富了基因功能研究的證據(jù)。研究方案中通常會(huì)設(shè)計(jì)創(chuàng)制基因敲除突變體、回復(fù)突變體和超表達(dá)突變體。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期克隆到玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因 序列，并創(chuàng)制了基因敲除突變體（結(jié)果待發(fā)表），在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)構(gòu)建了含有色氨酸強(qiáng)啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白編碼基因GFP和草胺磷抗性基因bar的回復(fù)載體pBARKS1-MR-eGFP，可將重組的載體通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米大斑病菌黑色素合成基因 缺失突變體的原生質(zhì)體，或玉米大斑病菌野生型菌株的原生質(zhì)體，利用草胺磷抗性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)獲得草胺磷抗性轉(zhuǎn)化子，通過分析bar基因、GFP基因及2個(gè)同源臂DNA序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR初步篩選，將篩選的轉(zhuǎn)化子用bar基因和GFP基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern blot驗(yàn)證是否為該基因的回復(fù)突變體或超表達(dá)突變體，并對(duì)該突變菌株進(jìn)行各項(xiàng)研究分析，如表型分析，附著胞形成能力及穿透能力、毒素產(chǎn)生能力、分生孢子萌發(fā)及突變菌株的侵染能力等，從而對(duì) 基因功能進(jìn)行深入研究。另外，該載體含有綠色熒光蛋白基因GFP，在生物體內(nèi)可以表達(dá)綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡（熒光共聚焦顯微鏡）定位目的蛋白的位置。

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