莫熙禮　吳彤林　李松克等

摘要： 從角質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶以及細(xì)胞膜透性等方面研究花椒提取物對(duì)薏苡黑粉病菌的抑制機(jī)理。結(jié)果表明：花椒提取物處理后，黑粉病菌的果膠酶和纖維素酶的活性顯著弱于對(duì)照，說(shuō)明花椒提取物能夠抑制病原物的致病相關(guān)酶活性的表達(dá)，進(jìn)而減輕黑粉病菌的危害；花椒提取物處理后，孢子培養(yǎng)液的電導(dǎo)率及其變化率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而變大，處理9 h后菌絲電導(dǎo)率變化率為9.52%，說(shuō)明花椒提取物對(duì)菌絲的細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而迅速增加菌絲培養(yǎng)液的電導(dǎo)率。黑粉病菌的果膠酶以及纖維素酶的活性都在6 h時(shí)達(dá)到峰值，之后活性開(kāi)始降低，說(shuō)明該病菌在6 h時(shí)能夠沖破植物各種抵抗屏障，成功侵入寄主植物。黑粉病菌分泌的角質(zhì)酶的量很低，這可能是薏苡黑粉病菌極少能從薏苡葉片侵入的關(guān)鍵因子之一。

關(guān)鍵詞： 花椒；抑制機(jī)理；黑粉病菌；薏苡

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.19 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0131-02

薏苡（Coix lacrymajobi L.var. frumentac）別稱(chēng)六谷子、珍珠米等，是貴州省黔西南極具特色的主要經(jīng)濟(jì)作物，為貴州省黔西南州農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民增收作出了重要貢獻(xiàn)。近年來(lái)，隨著薏苡種植規(guī)模的擴(kuò)大，薏苡黑粉病大面積頻繁發(fā)生，直接影響了薏苡的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)，已成為薏苡生產(chǎn)的重要制約因素，對(duì)貴州省黔西南州薏苡種植區(qū)農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。植物源殺菌劑對(duì)薏苡黑粉病抑制作用方面的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。由于對(duì)該病害的病原物還不甚了解，因此對(duì)該病害的防治也比較盲目。植物源殺菌劑是指用具有殺菌、抑菌活性的植物部位或有效成分提取物以及分離純化的單體物質(zhì)加工而成的用于防治植物病害的藥劑 [1]。因此，加強(qiáng)新型天然植物源殺菌劑的研制具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物病原菌侵入植物需要克服2道屏障——角質(zhì)層和細(xì)胞壁。病原物通過(guò)合成和分泌角質(zhì)酶降解植物體表的角質(zhì)，以沖破第1道屏障，降低植物自身的防御能力 [2]。很多植物病原菌都能分泌各種細(xì)胞壁降解酶，這些酶能夠降解細(xì)胞壁，是真菌的重要致病因子之一 [3]。因此，本試驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，從花椒提取物對(duì)薏苡黑粉病菌角質(zhì)酶和細(xì)胞降解酶的抑制作用方面研究植物提取物抑菌機(jī)制，為進(jìn)一步闡明植物提取物對(duì)病原菌抑制機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌

薏苡黑粉病菌采集于黔西南州農(nóng)作物科學(xué)研究所薏苡示范基地。在薏苡果實(shí)上分離得到病瘤，風(fēng)干后存放于紙盒內(nèi)，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们皩⒉×瞿胨椴⑦^(guò)40目篩，得到菌粉。

1.2 花椒提取物的制備

花椒采集于貴州省興義市頂效。將陰干的植物材料放至恒溫烘箱內(nèi)50 ℃烘干，粉碎后過(guò)40目篩，置于密封袋中，低溫保存?zhèn)溆??；ń返奶崛〔扇EP提取法 [4]，將花椒提取物配制成濃度為0.125 mg/mL的溶液。

1.3 角質(zhì)酶活性的測(cè)定

稱(chēng)取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL角質(zhì)酶培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對(duì)照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測(cè)定角質(zhì)酶活性的變化。角質(zhì)酶培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取及酶活性的測(cè)定（波長(zhǎng)405 nm）參考吳潔云的方法 [5]。以1 mg酶蛋白 1 min 內(nèi)吸光度為1個(gè)酶單位（U）。

1.4 β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶（EG）活性的測(cè)定

稱(chēng)取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL EG培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對(duì)照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測(cè)定EG活性的變化。培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取以及EG活性（540 nm）的測(cè)定參考董小梅的方法 [6]。以1 h 1 mg蛋白催化底物產(chǎn)生 1 μmol 還原糖所需的酶量為1個(gè)酶單位（U）。

1.5 果膠酶活性的測(cè)定

稱(chēng)取0.05 mg菌粉放置于1 000 mL果膠酶培養(yǎng)液中，分為2等份。處理組添加10 mL花椒提取物溶液，對(duì)照（CK）添加10 mL蒸餾水，分別于處理后0、3、6、9 d測(cè)定多聚半乳糖酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的變化。果膠酶培養(yǎng)液的配制、酶粗液的提取、PG以及PMG活性的測(cè)定（540 nm）參考楊迎青等的方法 [7]。以1 h 1 mg蛋白催化底物產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1酶單位（U）。

1.6 細(xì)胞膜透性的檢測(cè)

細(xì)胞膜透性的測(cè)定參考楊海清的方法 [8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒提取物對(duì)黑粉病菌角質(zhì)酶活性的影響

由圖1可知，花椒提取物處理后，薏苡黑粉病菌孢子產(chǎn)生角質(zhì)酶活性與對(duì)照處理差異不明顯，且角質(zhì)酶活性都很弱。對(duì)照和花椒處理的角質(zhì)酶都在6 h時(shí)到達(dá)峰值。

2.2 花椒提取物對(duì)黑粉病菌EG活性的影響

由圖2可見(jiàn)，對(duì)照黑粉病菌EG活性增強(qiáng)較快，于6 h時(shí)達(dá)到峰值，且花椒提取物處理的黑粉病菌EG活性明顯弱于對(duì)照。說(shuō)明花椒提取物能夠減弱制病菌的EG活性。

2.3 花椒提取物對(duì)黑粉病菌果膠酶活性的影響

圖3、圖4表明，對(duì)照病菌PG、PMG活性從開(kāi)始就逐漸增強(qiáng)，于6 h時(shí)都到達(dá)峰值，而花椒提取物處理病菌PG、PMG活性在試驗(yàn)過(guò)程中增強(qiáng)不明顯。說(shuō)明花椒提取物對(duì)黑粉病菌果膠酶有抑制作用。

2.4 花椒提取物對(duì)薏苡黑粉菌細(xì)胞膜透性的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，經(jīng)花椒提取物處理后，孢子培養(yǎng)液的電導(dǎo)率及其變化率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而變大。經(jīng)花椒提取物處理6 d后，菌絲的電導(dǎo)率顯著高于CK。處理9 h后，菌絲的電導(dǎo)率變化率達(dá)到9.52%。說(shuō)明花椒提取物對(duì)菌絲的細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，從而迅速提高了菌絲培養(yǎng)液的電導(dǎo)率。

3 結(jié)論與討論

角質(zhì)層是阻止病原真菌侵入寄主植物的第1道屏障，很多植物病原菌通過(guò)合成和分泌角質(zhì)酶迅速降解寄主植物的角質(zhì)，降低其防御能力，以達(dá)到侵害的目的 [2]。國(guó)外學(xué)者在病原物侵入位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了角質(zhì)酶的存在，且病原物的致病性與角質(zhì)酶的表達(dá)量呈正相關(guān) [9]。因此，降低某種病原物角質(zhì)酶的表達(dá)量，可以一定程度上減輕該病原物的危害。Li等研究發(fā)現(xiàn)，缺少角質(zhì)酶基因的菌株不能直接沖破油菜葉片的角質(zhì)層 [10]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑粉病菌分泌的角質(zhì)酶的量很小，可能不足以破壞寄主的角質(zhì)層。這可能是薏苡黑粉病菌極少能從薏苡葉片侵入的重要因子之一。

細(xì)胞壁是阻止病原真菌侵入的第2道屏障，大部分植物病原真菌通過(guò)分泌細(xì)胞壁降解酶降解細(xì)胞壁，從而達(dá)到危害寄主植物的目的 [3]。因此，提高植物抵抗細(xì)胞壁降解酶的能力或者抑制細(xì)胞壁降解酶的表達(dá)量，可以達(dá)到減輕病原物危害的目的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)花椒提取物處理薏苡黑粉病菌后，該病菌的細(xì)胞壁降解酶（β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶、多聚半乳糖酸酶以及果膠甲基半乳糖醛酸酶）表達(dá)量明顯低于對(duì)照，說(shuō)明花椒提取物對(duì)病原菌的細(xì)胞壁降解酶具有很強(qiáng)的抑制作用。

本試驗(yàn)用電導(dǎo)率儀測(cè)定了花椒提取物對(duì)薏苡黑粉病菌菌絲細(xì)胞膜的影響，結(jié)果表明花椒提取物對(duì)黑粉病菌菌絲細(xì)胞膜具有很強(qiáng)的破壞作用，破壞作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，這與楊海清的研究結(jié)果 [8]相符。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，薏苡黑粉病菌細(xì)胞壁降解酶活性均在 6 h 時(shí)達(dá)到峰值，之后開(kāi)始減弱。說(shuō)明該病菌只需6 h就能夠完全激發(fā)各種致病相關(guān)酶的活性，最大程度破壞寄主植物的各種抵抗屏障，成功侵入寄主植物。

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