謝兵　周杰　朱樹華

摘要：以新疆紅肉蘋果為試材，研究其生長(zhǎng)發(fā)育過程中果肉花青素合成代謝的變化。結(jié)果表明：新疆紅肉蘋果果肉中的花青素含量從5月18日～6月11日逐漸減少，從7月5日～7月29日緩慢增長(zhǎng)；在成熟的果實(shí)中，果肉花青素的含量是0.36 mg·g-1FW，高于普通品種的蘋果，說明新疆紅肉蘋果是潛在的、良好的花青素來源；在新疆紅肉蘋果中，可溶性糖含量與類胡蘿卜素含量呈顯著負(fù)相關(guān)（R=-0.75），花青素含量與類胡蘿卜素含量呈顯著正相關(guān)（R=0.79），花青素含量與苯丙氨酸解氨酶（PAL）、花色素合成酶（ANS）之間沒有明顯的相關(guān)性，顯示可能存在一些消耗花青素的途徑。

關(guān)鍵詞：新疆紅肉蘋果；花青素；葉綠素；類胡蘿卜素；苯丙氨酸解氨酶；花色素合成酶

中圖分類號(hào)：S661.101 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）08-0025-05

Abstract The changes of anthocyanin metabolism in Xinjiang red-flesh apple [Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck） Langenf.]were studied during fruit development. The anthocyanin content in flesh decreased gradually from May 18 to June 11， but increased slowly from July 5 to July 29. In mature fruits， the anthocyanin content was 0.36 mg·g-1FW， which were higher than that of common cultivars. It suggested that the Xinjiang red-flesh apple was a potential and good source of anthocyanin. There was significantly negative correlation （R=-0.75） between soluble sugar content and carotenoid content， and significantly positive correlation （R=0.79） between anthocyanin content and carotenoid content； no significant correlations were found between anthocyanin content and the activities of pheammonialyase （PAL） and anthocyanidin synthase （ANS）， which implied some pathways to consume anthocyanin.

Key words Xinjiang red-flesh apple；Anthocyanin； Chlorophyll； Carotenoid； PAL； ANS

新疆野蘋果是第三紀(jì)孑遺物種，被認(rèn)為是栽培蘋果的祖先[1，2]。新疆紅肉蘋果是新疆野蘋果的一種，果實(shí)和葉子中色素含量高，果皮和果肉在生長(zhǎng)過程中和成熟后都保持著紅色，被認(rèn)為是重要的觀賞和醫(yī)用植物資源。花青素是一組天然色素，屬于類黃酮，是很多水果呈現(xiàn)紅藍(lán)色的原因，在人類健康領(lǐng)域有著重要影響[3]。研究發(fā)現(xiàn)，攝入富含花青素的食物可以減少心血管疾病[4， 5]、癌癥[6]、糖尿病[7]和其他慢性疾病[8]的發(fā)病率。

花青素的生物合成來源于苯丙烷的代謝，由一系列的酶反應(yīng)步驟組成。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷合成路徑的一個(gè)重要分支點(diǎn)，而花色素合成酶（ANS）能催化無色花色素向花青素轉(zhuǎn)化。多項(xiàng)研究表明，PAL和ANS活性與花青素在蘋果果實(shí)中的累積有著密切聯(lián)系[9， 10]。然而，已有研究多集中在培育新疆野蘋果上，關(guān)于花青素生物合成和新陳代謝的研究很少。本試驗(yàn)主要研究了花青素在新疆紅肉蘋果發(fā)育中的代謝情況，為新疆紅肉蘋果的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用新疆紅肉蘋果均采自新疆石河子市。自5月18日（開花后2周）開始，至7月29日（近成熟）止，每12天采摘一次，每次采摘100個(gè)，共采摘7次。果肉經(jīng)液氮處理后儲(chǔ)藏在-80℃冰箱中，試驗(yàn)前研磨成細(xì)粉備用。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 花青素含量的測(cè)定 采用Rabino[11]和Xavier[12]等的方法測(cè)定。取100 g果肉細(xì)粉加入100 mL提取液（甲醇∶鹽酸∶去離子水= 25∶5∶70，體積比），32℃、150 r·min-1勻漿24 h。將勻漿用6層紗布過濾，取濾液于4℃、12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，分別于525、657 nm測(cè)吸光度?；ㄇ嗨睾坑霉剑ˋ525-0.25A657）/FW計(jì)算，以每單位鮮果質(zhì)量的花青素含量表示，單位為mg·g-1FW。

1.2.2 葉綠素和類胡蘿卜素含量的測(cè)定 采用Lichtenthaler[13]方法測(cè)定。取100 g果肉細(xì)粉用10～15 mL 95%乙醇和石英砂、碳酸鈣萃取。勻漿用6層紗布過濾，取濾液于4℃、12 000 r·min-1離心20 min，收集上清，分別于665、649、470 nm測(cè)吸光度。葉綠素含量以每單位鮮果質(zhì)量的葉綠素含量表示，類胡蘿卜素含量以每單位鮮果質(zhì)量的類胡蘿卜素含量表示，單位均為mg·g-1FW。

1.2.3 可溶性糖含量的測(cè)定 采用Yemm等[14]的蒽酮比色法測(cè)定，取5 g果肉細(xì)粉加50 mL蒸餾水，封口膜封口，沸水浴1 h，然后10 000 r·min-1離心15 min，取0.5 mL上清液，加1.5 mL蒸餾水，測(cè)630 nm吸光度。endprint

1.2.4 PAL活性測(cè)定 采用Lister[15]方法測(cè)定。取50 g果肉樣品細(xì)粉加入到50 mmol·L-1鹽酸緩沖試劑（pH 7.0，含50 mmol·L-1抗壞血酸鈉溶液，18 mmol·L-1巰基乙醇）60 mL中混勻。勻漿用6層紗布過濾，取濾液于4℃、12 000 r·min-1離心5 min。收集上清液，冰浴保存。

將17 mL提取液加入到等體積含11 mmol·L-1苯丙氨酸的反應(yīng)液中，混勻，在34℃反應(yīng)30 min，加入35%（w/v）三氟乙酸125 μL以停止反應(yīng)?；旌衔镉? 000 r·min-1離心5 min，取上清液在波長(zhǎng)285 nm測(cè)其吸光度，平行測(cè)定3次。以每分鐘A285增加0.01為一個(gè)酶活性單位（U）。PAL活性單位為U·g-1FW。

1.2.5 ANS活性測(cè)定 采用Nakajima等[16]的方法。取50 g果肉細(xì)粉加入20 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.0，含200 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1二硫蘇糖醇，10%甘油，4 mmol·L-1抗壞血酸鈉）60 mL混勻。勻漿用6層紗布過濾，取濾液于4℃、12 000 r·min-1離心5 min。收集上清，冰浴保存。

取17 mL提取液加入到等體積含有0.1 mmol·L-1兒茶酸、0.4 mmol·L-1 FeSO4、1 mmol·L-1 2-酮戊二酸的反應(yīng)液中，混勻，30℃反應(yīng)1 h，加入34 μL濃鹽酸終止反應(yīng)。在520 nm測(cè)其吸光度，平行測(cè)定三次。以每分鐘A520增加0.01為一個(gè)酶活性單位（U）。ANS活性單位表示為U·g-1FW。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素、葉綠素和類胡蘿卜素含量

由圖1可見，5月18日花青素含量為1.38 mg·g-1FW，7月29日花青素含量為0.36 mg·g-1FW，5月18日～6月11日，新疆紅肉蘋果花青素含量逐漸降低；6月11日～7月5日，花青素含量變幅較??；7月5日～7月29日，花青素含量逐漸升高。葉綠素含量在新疆紅肉蘋果生長(zhǎng)過程中分別在6月11日和7月5日出現(xiàn)兩個(gè)峰值，且數(shù)值持平，整體變化趨勢(shì)呈“M”型。葉綠素與花青素含量變化呈相反趨勢(shì)，當(dāng)葉綠素含量達(dá)到兩個(gè)峰值時(shí)，花青素含量都處于最小值。

5月18日～7月5日和7月5日～7月29日，新疆紅肉蘋果類胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)相同，均為先降低后升高，且分別在6月11日和7月17日達(dá)到最小值。在收獲果實(shí)前，類胡蘿卜素含量緩慢增長(zhǎng)。

2.2 可溶性糖含量

由圖2可知，5月18日～7月5日和7月5日～7月29日，新疆紅肉蘋果可溶性糖含量均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，分別在6月11日和7月17日出現(xiàn)兩個(gè)峰值，后者為前者的86%。

2.3 PAL活性

如圖3所示，PAL活性在新疆紅肉蘋果的生長(zhǎng)過程中表現(xiàn)不穩(wěn)定?？傮w來看，PAL活性呈先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)，在5月30日時(shí)達(dá)到最小值，6月11日急劇增加到最大值，6月11日～7月29日，緩慢波動(dòng)下降。之前報(bào)道中也出現(xiàn)過相似的結(jié)果，PAL活性在未成熟的果實(shí)中最高，隨著生長(zhǎng)逐漸下降，成熟時(shí)的活性將低于初始活性[15]。

2.4 ANS活性

如圖3所示，5月18日～6月23日和6月23日～7月29日，新疆紅肉蘋果ANS活性均為先升高后降低的變化趨勢(shì)，分別在6月11日和7月17日出現(xiàn)峰值。ANS最終活性略高于初始活性。

2.5 相關(guān)性分析

在新疆紅肉蘋果中，花青素含量與ANS、PAL活性之間相關(guān)性非常低；與可溶性糖和葉綠素含量之間相關(guān)不顯著；但與類胡蘿卜素含量呈顯著正相關(guān)。類胡蘿卜素含量與可溶性糖含量之間也有顯著的負(fù)相關(guān)性，其余指標(biāo)間則相關(guān)不顯著。盡管顯著性不高，花青素含量與葉綠素含量之間呈負(fù)相關(guān)，可溶性糖含量與ANS活性之間呈正相關(guān)（見表1）。

3 結(jié)論與討論

新疆紅肉蘋果中花青素含量明顯高于非新疆紅肉蘋果，Wu等[17]研究表明新疆紅肉蘋果中花青素含量為0.013～0.123 mg·g-1FW，高于非新疆紅肉蘋果Scugog蘋果；Mazza等[18]測(cè)定的Scugog蘋果中花青素含量為0.095～0.10 mg·g-1FW。與其他水果中花青素含量相比較，草莓[19]為1.20～1.71 mg·g-1FW，紅葡萄[20]為0.069～0.15 mg·g-1FW，黑醋栗[21]為1.52～2.81 mg·g-1FW，黑莓[22]為1.26～1.52 mg·g-1FW，藍(lán)莓[23]為0.25～4.95 mg·g-1FW。本研究發(fā)現(xiàn)，7月29日果實(shí)近成熟時(shí)花青素含量為0.36 mg·g-1FW，表明新疆紅肉蘋果具有成為食物和營(yíng)養(yǎng)品中花青素來源的潛在價(jià)值。

花青素含量隨新疆紅肉蘋果生長(zhǎng)的變化與其它水果有很大區(qū)別。在大多數(shù)水果品種中，花青素含量隨著果實(shí)生長(zhǎng)而增加，如荔枝果皮[24]、歐洲甜櫻桃[25]、納瓦霍人黑莓[26]、紅金蘋果[27]、嘎啦蘋果皮[28]等；且在大多數(shù)蘋果品種中，果肉和果皮在未成熟果實(shí)中是不著色的，而是隨著果實(shí)的逐漸成熟而著色。但在新疆紅肉蘋果中，果肉在剛結(jié)出果實(shí)的時(shí)候就已經(jīng)是紅色，因此在蘋果發(fā)育初期，花青素含量很高。

在新疆紅肉蘋果發(fā)育早期（5月18日～6月23日），花青素含量減少，可能是因?yàn)榛ㄇ嗨氐目寡趸钚越档退?。?jù)報(bào)道，花青素可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[28]，在植物生長(zhǎng)和環(huán)境改變的條件下，花青素經(jīng)常出現(xiàn)積累瞬變——出現(xiàn)或消失[30]。花青素含量隨著果實(shí)發(fā)育而減退已經(jīng)在青椒中證實(shí)[31]?；ㄇ嗨剡€有光保護(hù)功能[32]，也可以抵抗感光氧化和紫外線的傷害[33]，Mohr等[34]表明花青素可以降低光損害水平，特別是能降低高能藍(lán)色波長(zhǎng)破壞原葉綠素。在新疆紅肉蘋果產(chǎn)地新疆，日光從5月份開始變得強(qiáng)烈，這正是葉綠素合成率高的一個(gè)階段，花青素合成和降解可能是因?yàn)楣獾膹?qiáng)度不同，以確保葉綠素的生物合成。花青素減少也可能是因?yàn)樗L(zhǎng)的稀釋效應(yīng)導(dǎo)致。endprint

在新疆紅肉蘋果中，類胡蘿卜素和花青素參與果實(shí)的著色，且類胡蘿卜素含量與花青素含量顯著正相關(guān)，然而類胡蘿卜素的橙色被花青素的顏色所掩蓋。McGlasson[35]和Hiratsuka[36]等研究表明植物激素脫落酸促進(jìn)花青素的生物合成。單一顏色的水果會(huì)提高植物激素脫落酸的應(yīng)用，從而導(dǎo)致像葡萄皮[37]和櫻桃皮[38]中花青素含量的增加。因此，在果實(shí)發(fā)育的早期階段，類胡蘿卜素的減少也可能是花青素含量降低的一個(gè)原因。在新疆紅肉蘋果發(fā)育后期，類胡蘿卜素和花青素含量都逐漸累積。

已有研究表明，可溶性糖能刺激花青素的積累，如在擬南芥[40]、玉米[41]和葡萄[42]中。然而本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量與花青素含量之間無明顯的相關(guān)性，但與ANS活性之間呈正相關(guān)，分析可能是可溶性糖含量累積刺激ANS的活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ANS活性較高時(shí)，葉綠素含量也較高，而花青素含量較低，反之亦然。分析可能是由于在葉綠素生物合成階段，ANS活性處在較高的階段，而花青素通過快速合成和降解來抵抗組織受到的光損傷，所以花青素含量明顯處在較低水平。

在非新疆紅肉蘋果中，PAL活性的增長(zhǎng)是對(duì)金冠蘋果和綠蘋果[43]的研究中發(fā)現(xiàn)的。PAL通常被認(rèn)為是類黃酮生物合成中的主要限制因素[44]。然而，在本研究中發(fā)現(xiàn)，花青素含量和PAL活性之間沒有明顯的正相關(guān)性。分析原因可能是花青素只代表類黃酮化合物的一小部分，反饋抑制可能是關(guān)閉或減少酶活性的更有效的途徑，也可能還存在其它消耗花青素的途徑，同時(shí)來抵抗光損傷。

參 考 文 獻(xiàn)：

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