張雪瑩　李太強(qiáng)　王洪剛等

摘要：充分挖掘植物自身磷高效利用的生物學(xué)潛力，提高農(nóng)作物對(duì)土壤難溶性磷的吸收和利用效率，對(duì)于培育磷高效利用的作物新品種、減少肥料投入和保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。PHR1基因是植物磷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要低磷應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，本研究利用同源克隆的方法，分別從小麥近緣植物濱麥草和百薩偃麥草中克隆獲得了其PHR1基因序列。濱麥草LmPHR1和百薩偃麥草TbPHR1基因的ORF均為1 356 bp，編碼451個(gè)氨基酸；與已報(bào)道的小偃54A1、B1、D1的PHR1基因高度同源，一致性達(dá)到98.63%；對(duì)兩基因的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明它們均具有MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)預(yù)測(cè)的CC（Coiled coil）結(jié)構(gòu)域；利用ClustalX軟件對(duì)已報(bào)道的水稻、小麥等PHR1基因進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，TbPHR1基因與二穗短柄草、水稻、玉米、擬南芥的PHR1基因在進(jìn)化關(guān)系上更近一些，而LmPHR1基因與其他植物的PHR1基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：濱麥草；百薩偃麥草；PHR1基因；同源克隆

中圖分類號(hào)：S512.9+S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）08-0001-06

Abstract To fully explore the plant potential for high-efficiency phosphorus utilization and enhance the plant absorption and use efficiency of insoluble phosphorus in soil will play important roles in breeding new varieties， reducing fertilizer input and protecting agro-ecological environment. PHR1 is an important transcription factor of multiple Pi starvation responses in Pi signaling pathways. By homologous cloning， two PHR1 genes were cloned from Elymus mollis and Thinopyrum bessarabicum， which were named as LmPHR1 and TbPHR1. Their ORFs were both 1 356 bp， and both of them encoded 451 amino acids； their cDNA sequences shared 98.63% identity with the cDNA sequences of Xiaoyan 54 PHR1-A1， PHR1-B1， PHR1-D1. Their encoded proteins both had a MYB DNA binding domain and a predicted coiled-coil domain. Using the ClustalX for phylogenetic analysis of the two PHR1 genes with the reported PHR1 genes in rice and wheat， ect. The results showed that PHR1 had closer evolutionary relationship with the PHR1s from Brachypodium distachyon， Oryza sativa， Zea mays and Arabidopsis thaliana； while the LmPHR1 had more faraway evolutionary relationship with other plants PHR1 genes.

Key words Leymus mollis； Thinopyrum bessarabicum； PHR1 gene； Homologous clone

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，然而由于被土壤固定成為植物難以利用的形式（如有機(jī)磷、磷酸鋁、磷酸鐵等）或隨水流失，磷肥的利用率很低，導(dǎo)致土壤磷的“遺傳學(xué)缺乏”，即土壤中總磷含量高，但能被植物吸收利用的磷（有效磷）卻很低[1～3]。

磷缺乏是影響植物生長(zhǎng)的一個(gè)主要營(yíng)養(yǎng)脅迫。植物已進(jìn)化出一系列復(fù)雜的代謝途徑來適應(yīng)環(huán)境長(zhǎng)期的磷元素營(yíng)養(yǎng)缺乏，主要通過誘發(fā)形態(tài)學(xué)的變化、生理生化過程的變化以及與菌類共生等，這些統(tǒng)稱為低磷脅迫應(yīng)答反應(yīng)。這些應(yīng)答反應(yīng)涉及數(shù)百個(gè)磷脅迫可誘導(dǎo)基因的協(xié)同作用，它們可以調(diào)整植物體內(nèi)磷利用的優(yōu)先順序，同時(shí)提高體外對(duì)磷的吸收[4]。最近幾年通過對(duì)擬南芥和水稻兩種模式植物的低磷芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，植物對(duì)低磷反應(yīng)的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，目前已經(jīng)分離鑒定到了多個(gè)參與低磷反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，包括：PHR1、WRKY75、ZAT6、MYB62、PTF1、bHLH32。PHR1屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子，是第一個(gè)鑒定到的參與擬南芥低磷反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，它以二聚體的形式結(jié)合在磷響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)P1BS序列，調(diào)控下游基因的表達(dá)[5～7]；最新研究表明，PHR1基因在磷脅迫光合作用調(diào)控中也起重要作用，并在磷脅迫時(shí)參與調(diào)控脂質(zhì)重塑和三酰甘油積累[8，9]。目前已從多種植物中克隆到了PHR1基因，如擬南芥[5]、水稻[10]、小麥[11]、玉米[12]、歐洲油菜[13]等。

濱麥草（Leymus mollis，2n=28，JJNN）和百薩偃麥草（Thinopyrum bessarabicum，2n=14，JJ）是小麥重要的野生近緣植物，濱麥草屬植物主要集中于環(huán)境條件惡劣地區(qū)，因此保留了野生植物的抗性、耐逆等優(yōu)良基因，具有耐鹽堿、耐旱、耐瘠薄等優(yōu)良耐力以及抗葉銹病、條銹病、稈銹病、白粉病、赤霉病、蚜蟲等優(yōu)良抗性[14]。百薩偃麥草為自花授粉的多年生海岸禾草，原產(chǎn)于黑海和地中海沿岸，是偃麥草屬中基因組最簡(jiǎn)單的二倍體物種，對(duì)環(huán)境脅迫和生物脅迫具有很強(qiáng)的抗性，是小麥遺傳改良的重要資源，研究人員已利用遠(yuǎn)緣雜交等手段將其部分優(yōu)良特性基因轉(zhuǎn)入小麥[15]。然而，現(xiàn)有研究主要集中在抗病基因的挖掘上，對(duì)于抗逆境耐瘠薄等基因的研究很少。endprint

本研究以濱麥草和百薩偃麥草為材料，克隆其PHR1基因并進(jìn)行序列和遺傳進(jìn)化分析，為今后小麥磷高效新品種的培育及遺傳改良提供優(yōu)良的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為濱麥草（Leymus mollis）與百薩偃麥草（Thinopyrum bessarabicum），濱麥草引自西北農(nóng)林科技大學(xué)，百薩偃麥草引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，均種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈的合成 取濱麥草與百薩偃麥草幼葉，利用RNAsimple Total RNA Kit（天根公司）提取植物總RNA，提取步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。cDNA第一鏈合成用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（全式金公司），步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因克隆 以cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增目的基因，所用引物為F（5′-ATGAGGARGTKTGATCTGAGRC-3′）、R（5′-TTAACTATCATGCASYCTWCG-3′）。PCR反應(yīng)體系為15 μL，依次加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，LA Taq 0.2 μL，Buffer I 7.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.4 μL，正向引物（10 mmol/L）1 μL，反向引物（10 mmol/L）1 μL，最后加水至15 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。將回收片段連pEASY-T1載體（全式金公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取陽性克隆送上海桑尼公司測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 將序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast比對(duì)，下載其他物種的PHR1基因序列及蛋白序列。利用DNAMAN軟件，對(duì)PHR1的cDNA序列及蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

2.1 LmPHR1和TbPHR1基因的克隆及序列分析

以濱麥草和百薩偃麥草cDNA為模板，利用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了各自的PHR1基因全長(zhǎng)，分別命名為L(zhǎng)mPHR1和TbPHR1。兩基因的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）均為1 356 bp，編碼451個(gè)氨基酸。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TTA。LmPHR1和TbPHR1與報(bào)道的小偃54A1、B1、D1的PHR1基因序列一致性均為98.63%（見圖1）。

2.2 同源性分析

利用DNAMAN軟件對(duì)推導(dǎo)的LmPHR1和TbPHR1氨基酸序列與擬南芥、大麥、玉米、水稻、小麥的PHR1氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖2）顯示，氨基酸序列比對(duì)一致性為79.88%，LmPHR1和TbPHR1與小偃54和大麥的PHR1氨基酸序列同源性較高，而與水稻、玉米、擬南芥的氨基酸同源性較低；保守結(jié)構(gòu)域及特征序列的同源性相對(duì)較高一些，均存在MYB-like DNA-binding結(jié)構(gòu)域和MYB-CC-LHEQLE轉(zhuǎn)錄激活域，其中DNA-binding結(jié)構(gòu)域由55個(gè)氨基酸組成，在不同的植物中非常保守。

2.3 LmPHR1和TbPHR1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解LmPHR1和TbPHR1與其他植物PHR1之間的進(jìn)化關(guān)系，在多重比對(duì)的基礎(chǔ)上，用上述9個(gè)PHR1基因序列與二穗短柄草的PHR1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，TbPHR1與二穗短柄草和小偃54的PHR1基因的進(jìn)化關(guān)系更近一些，而LmPHR1與其他植物的PHR1基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

PHR1被認(rèn)為是植物磷脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心調(diào)控因子，其表達(dá)水平基本不受外界磷濃度的影響，但控制著一部分低磷反應(yīng)，如花青素的積累以及部分IPS基因的表達(dá)。本研究成功克隆了濱麥草與百薩偃麥草的PHR1基因的全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行了序列比較和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，LmPHR1和TbPHR1均與小偃54的PHR1基因序列和氨基酸序列高度同源，與已報(bào)道的大麥PHR1氨基酸序列一致性也較高，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因序列高度保守；在進(jìn)化關(guān)系上，TbPHR1與二穗短柄草和小偃54進(jìn)化關(guān)系更近一些，而LmPHR1與其他植物的PHR1進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。該試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究LmPHR1和TbPHR1的功能及磷脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為小麥磷高效新品種的培育及利用基因工程手段改良小麥提供了優(yōu)良的基因資源。

參 考 文 獻(xiàn)：

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