湯琴,尹家瑜,朱曉雯,張盈盈,周靜東,鄧兆群(.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科,江蘇 鎮(zhèn)江 22002;2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院血液科,江蘇 金壇2200;.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 22002)
miR-93在急性髓系白血病中的表達(dá)及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性
湯琴1,2,尹家瑜1,朱曉雯1,張盈盈1,周靜東1,鄧兆群3
(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科,江蘇 鎮(zhèn)江 212002;2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院血液科,江蘇 金壇213200;3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇鎮(zhèn)江 212002)
目的:探討微小RNA-93(miR-93)在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)中的表達(dá)特點(diǎn)及其與miR-378表達(dá)的相關(guān)性。方法:用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)(RQ-PCR)檢測84例AML患者及16例健康對照骨髓單個(gè)核細(xì)胞中 miR-93成熟體的表達(dá)水平。分析 miR-93高表達(dá)對 AML患者預(yù)后的影響及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:84例 AML患者中有14例過表達(dá) miR-93(16.7%)。miR-93高表達(dá)組患者除白細(xì)胞數(shù)(3.11× 109/L)明顯低于低表達(dá)組(14.55×109/L,P=0.003)外,其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板等均無明顯差異。與其他核型分組[10/38(26.3%)]比較,中等預(yù)后核型分組中 miR-93高表達(dá)的頻率明顯下降[4/46(8.7%),χ2=4.652,P=0.041]。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示,miR-93表達(dá)率與 miR-378表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.321,P<0.01)。結(jié)論:miR-93在 AML中表達(dá)率明顯增加,且與miR-378表達(dá)率呈正相關(guān)。miR-93聯(lián)合 miR-378的表達(dá)可能作為 AML診斷的參考依據(jù)。
微小 RNA;微小 RNA93;急性髓性白血病
[Abstract]Objective:To investigate the expression of miR-93 in acute myeloid leukemia(AML)patients and the correlation between miR-93 and miR-378.Methods:Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression level of miR-93 in AML patients.The clinical significance of miR-93 expression in AML was investigated.Results:miR-93 overexpression was identified in 14(16.7%)of 84 AML patients.The patients with miR-93 overexpression had lower white blood cell level than those without miR-93 overexpression(3.11×109/L versus 14.55×109/L,respectively,P=0.003).Compared with other karyotype classifications,the frequency of miR-93 overexpression in the intermediate ones was lower[4/46(8.7%)versus 10/38(26.3%),P=0.041].Spearman correlation analysis revealed positive association between the two miRNAs,with r=0.321 between miR-93 and miR-378.Conclusion: miR-93 might serve as a diagnostic molecule with miR-378 in AML.
[Key words]microRNA;miR-93;acute myeloid leukemia
急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,表現(xiàn)為造血祖細(xì)胞的分化和增殖異常,從而導(dǎo)致致命性的感染、出血、器官浸潤等[1]。微小RNA是一類長度約為20~22 nt的真核生物內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA,參與人體內(nèi)多種重要的生理過程,包括細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等[2]。近年來研究顯示,微小RNA與 AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-93能夠促進(jìn)腫瘤的生長、血管的形成以及細(xì)胞的增殖[3-4]。miR-93的表達(dá)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌以及乳腺癌中均明顯增高,且與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)[5-8]。眾多研究表明,miR-93和 miR-378都是促癌基因[3,9]。但是,miR-93在AML中的表達(dá)狀況及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性尚未見報(bào)道。我們檢測了急性髓性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-93的表達(dá)量,并對其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析。
1.1 病例
84例AML患者均為2005年10月至2014年3月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院接受住院治療的初診病例,其中男48例,女36例,年齡10~87歲(中位53歲),診斷按 FAB和WHO 2008版標(biāo)準(zhǔn)(原始細(xì)胞≥20%)[10-11]。核型分析應(yīng)用常規(guī) R顯帶技術(shù),核型分組按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。對照組16例為疑似白血病患者,后經(jīng)骨髓穿刺病理學(xué)后而排除,且未患其他疾病。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞分離與 RNA制備 全部患者均于初診時(shí)抽取骨髓10 mL,肝素抗凝,用 Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用 mirVana miRNA試劑盒提取總RNA(Ambion公司,美國),經(jīng)紫外分光光度儀檢測 RNA濃度及純度[D(260 nm)/D(280 nm)比值在1.8~2.0間],-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 反轉(zhuǎn)錄
20 μL反應(yīng)體系包括蒸餾水14 μL、緩沖液4 μL、RNA 1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL(Qiagen公司,miScript Reverse Transcription Kit Cat.218061)混勻離心。PCR程序包括兩步:①37℃1 h,②95℃5 min,隨后4℃保持。
1.2.3 RQ-PCR檢測樣品中 miR-93成熟體的表達(dá)
引物設(shè)計(jì)采用 Primer Premier 5.0軟件,miR-93特異引物序列為5′-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGT-3′。內(nèi)參為U6管家基因,上游引物為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下 游 引 物 為 5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′,引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。20 μL PCR反應(yīng)體系包括賽博綠 PCR混合溶液10 μL,1.0 μmol/L的通用引物2 μL,以及1.0 μmol/L的特異性上游引物。反應(yīng)在ABI 7300擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司,美國)上進(jìn)行,擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性15 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸34 s,共40個(gè)循環(huán),熔解曲線程序?yàn)?5℃15 s,60℃60 s,95℃15 s,60℃15 s。每次擴(kuò)增均以重組 miR-93質(zhì)粒為陽性對照,以雙蒸水作為無模板對照(NTC)。選取 miR-93與U6表達(dá)ΔCT值最小的1例對照標(biāo)本作為參比對照,設(shè)定為1。miR-93基因表達(dá)量的計(jì)算采用如下公式:;ΔCT指對照與標(biāo)本之間miR-93與 U6循環(huán)閾值(CT)的差值。熔解曲線揭示PCR產(chǎn)物為單一峰。隨機(jī)選取2例 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序證實(shí)序列正確。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料間的差異分析采用 Kruskal-Wallis(多組間比較)或 Mann-Whitney U檢驗(yàn)(兩組比較),計(jì)數(shù)資料的差異分析采用卡方檢驗(yàn)或 Fisher確切概率法;miR-93表達(dá)與臨床資料之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩和檢驗(yàn);生存時(shí)間分析采用 Kaplan-Meier法;用 Spearman相關(guān)系數(shù)分析 miR-93與 miR-378的相關(guān)性;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 miR-93在兩組中的表達(dá)
16例對照的 miR-93表達(dá)水平在0.001316~1.000000(0.19±0.24)。因此,以0.43(均數(shù) +標(biāo)準(zhǔn)差)為界將 AML組分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。84 例AML患者中有14例(16.7%)為過表達(dá)miR-93。相應(yīng)對照組 miR-93的高表達(dá)率為6.25%(1/16)。對照組和 AML組的 miR-93的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
miR-93高表達(dá)組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于低表達(dá)組(P=0.003),兩組其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。AML組每個(gè)亞型都有 miR-93高表達(dá)的病例,但各型之間的高表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與其他核型分組[10/38(26.3%)]比較,中等預(yù)后組中 miR-93高表達(dá)的頻率明顯降低[4/46(8.7%),P=0.041]。
2.2 miR-93對預(yù)后的影響及與 miR-378的相關(guān)性
為了觀察AML患者中 miR-93高表達(dá)對患者預(yù)后的影響,我們對 84例患者中的 80例患者(失訪4例)進(jìn)行了生存分析,其中高表達(dá)組14例,低表達(dá)組66例。在完全緩解的43例中高表達(dá)組9例(64.3%),低表達(dá)組34例(51%)。兩組完全緩解率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.566)。所有患者中,生存總?cè)藬?shù)為34例,其中高表達(dá)組6例,低表達(dá)組28例,兩組(又各有1例失訪)的總體生存率的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[46%(6/13)與 43%(28/ 65),χ2=0.292,P=0.589]。在獲得完全緩解的AML患者中,miR-93高表達(dá)組和低表達(dá)組無復(fù)發(fā)生存率的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[75%(6/8)與84% (27/32),χ2=0.341,P=0.559]。Spearman相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示,miR-93與miR-378之間有明顯相關(guān)性(r=0.321,P<0.01)。見圖1。
表1 急性髓系白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞miR-93表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系
AML的致病機(jī)制與染色體異常和蛋白編碼基因等密切相關(guān)。近年來,miRNA在 AML發(fā)生發(fā)展中的作用以及調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。多數(shù)研究表明 miR-93能夠促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3,8,13]。但miR-93在 AML中的作用機(jī)制還不明確。
圖1 Spearman相關(guān)系數(shù)分析miR-93與miR-378間的相關(guān)性
本研究測定了84例 AML患者以及16例對照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-93的表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示,84例AML患者中有14例為過表達(dá) miR-93(16.7%),提示 miR-93表達(dá)可能作為診斷AML的生物分子,今后需要更多病例進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行 miR-93與 AML的相關(guān)性研究。miR-93高表達(dá)組與低表達(dá)組相比,除了白細(xì)胞計(jì)數(shù)低以外(3.11×109/L與14.55×109/L,P=0.003),其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhu等[14-15]通過測定患者血清 中的miR-93以及其他一些微小RNA的表達(dá)水平,推斷可以將多種微小 RNA一起作為非小細(xì)胞肺癌和AML的分子診斷學(xué)依據(jù)。Spearman相關(guān)系數(shù)分析得出 miR-93與 miR-378具有正相關(guān)性(r=0.321,P<0.01)。而我們以前的研究表明 miR-378對AML的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后可能有重大的意義[16]。miR-378和 miR-93已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的形成相關(guān)[3,9]。此次研究雖未有明確的數(shù)據(jù)證明 miR-93 對AML患者的預(yù)后有影響,但是miR-93與miR-378之間呈正相關(guān),且在預(yù)后中等核型分組中 miR-93高表達(dá)的頻率更低。因此,我們認(rèn)為miR-93在AML中出現(xiàn)過表達(dá)及與 miR-378表達(dá)正相關(guān),聯(lián)合檢測miR-93和miR-378的表達(dá)有可能作為 AML診斷的參考依據(jù)。
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Expression of miR-93 in AML and association between miR-93 and miR-378
TANG Qin1,2,YIN Jia-yu1,ZHU Xiao-wen1,ZHANG Ying-ying1,ZHOU Jing-dong1,DENG Zhao-qun3
(1.Department of Hematology,the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212002;2.Department Of Hematology,the Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University,Jintan Jiangsu 213200;3.Laboratory Centre,the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212002,China)
R733.71
A
1671-7783(2015)01-0068-04
10.13312/j.issn.1671-7783.y140262
國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172595,81270630);江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(BL2012056);江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目資助計(jì)劃(BRA2011085,BRA2013136)
湯琴(1972—),女,江蘇金壇人,碩士研究生;鄧兆群(通訊作者),副教授,碩士生導(dǎo)師,E-mail,dengqian2012@gmail.com
2014-10-10 [編輯]陳海林