王智耀，肖昌貴，倪　莉，張　雯，陳智超，劉志彬*（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108）

紅曲酸奶中乳酸菌變化情況研究

王智耀，肖昌貴，倪莉，張雯，陳智超，劉志彬*
（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108）

利用超聲波浸提法提取紅曲中的有效成分，將紅曲水提取液與全脂奶粉混合發(fā)酵制成新型紅曲酸奶。通過熒光原位雜交（FISH）技術(shù)跟蹤發(fā)酵過程中乳酸菌含量的變化，結(jié)果表明：紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著高于普通酸奶。發(fā)酵2 h時(shí)，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍；發(fā)酵5 h時(shí)，發(fā)酵接近終點(diǎn)，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。紅曲酸奶的保藏期可達(dá)15 d，乳酸菌數(shù)符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

乳酸菌；熒光原位雜交；紅曲酸奶

紅曲又名赤曲、丹曲、紅米，常以秈稻、粳米為主要原料，接種紅曲霉發(fā)酵后制成，具有消食活血、健脾燥胃的功效［1］。紅曲除用于肉制品著色和腐乳等行業(yè)外，作為一種性能優(yōu)良的糖化劑，也被廣泛地應(yīng)用在釀酒等飲品產(chǎn)業(yè)中，在食品領(lǐng)域占有重要的地位［2］。乳酸菌被認(rèn)是乳制品中應(yīng)用最為廣泛的細(xì)菌［3］，大多數(shù)乳酸菌為革蘭氏陽性桿菌或球菌。酸奶生產(chǎn)中常用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophi1us）和保加利亞乳桿菌（Lactobaci11us bu1garicus）作為混合發(fā)酵劑，接種到發(fā)酵基料中進(jìn)行酸奶制作［4］。研究表明，紅曲與酸奶結(jié)合后可改善乳酸菌發(fā)酵環(huán)境，促進(jìn)發(fā)酵體系內(nèi)乳酸菌的生長［7］，從而改變酸奶最終的風(fēng)味及營養(yǎng)成分，提升其口感與品質(zhì)。

熒光原位雜交（f1uorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)可將熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針與菌體細(xì)胞內(nèi)的特異rRNA片段雜交，通過熒光的激發(fā)達(dá)到檢測目的［8］。該方法的使用，不需對(duì)待測菌體進(jìn)行提前培養(yǎng)，對(duì)不可培養(yǎng)的菌體，能快速且準(zhǔn)確地測定其變化情況。本研究通過對(duì)紅曲米提取物、混合發(fā)酵劑混合全脂奶粉作為發(fā)酵基料，制成新型紅曲酸奶。結(jié)合熒光原位雜交（FISH）技術(shù)［9］，分析不同發(fā)酵時(shí)間乳酸菌含量變化，探討紅曲對(duì)乳酸菌生長的影響，為紅曲酸奶的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

全脂奶粉：光明乳業(yè)有限公司；紅曲米：市售；酸奶濃縮凍干發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophi1us）2×1011CFU/g、保加利亞乳桿菌（Lactobaci11us bu1garicus）5×1010CFU/g）：杜邦丹尼斯克公司；白砂糖：太古糖業(yè)（中國）有限公司。

草酸銨、番紅、NaC1、KC1、Tris、HC1、乙二胺四乙酸、KH2PO4、K2HPO4等試劑均為國產(chǎn)分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶、多聚甲醛、去離子甲酰胺等：上海生工生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

GTTP02500型0.2μm聚碳酸酯濾膜：默克密理博公司；2000S型熒光顯微鏡：日本尼康公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

熒光實(shí)驗(yàn)選用EUB338探針。探針的5’端上標(biāo)記A1exa F1uor488染料，染料在藍(lán)色激發(fā)波長下發(fā)出綠光，由上海生工合成。探針EUB338序列為GCTGCCTCCCGTAGGAGT （5’-3’），其中GC含量為66.67%，溫度為61.86℃。

1.3方法

1.3.1紅曲酸奶制備的工藝流程及操作要點(diǎn)

紅曲米的前處理：紅曲米經(jīng)粉碎機(jī)磨碎并過80目篩，得到紅曲米粉；在紅曲米粉中加入蒸餾水，在超聲裝置中處理20 min，充分提取紅曲米中的營養(yǎng)成分［10］；超聲波處理后在室溫條件下充分浸提2 h，浸提過程持續(xù)攪拌；將所得到的溶液進(jìn)行過濾，即得紅曲水提液。

發(fā)酵劑的制備：將嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌以1∶1的比例，接種到經(jīng)過121℃、5 min滅菌處理后冷卻的脫脂奶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，全過程于無菌超凈工作臺(tái)操作。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以充分活化乳酸菌；培養(yǎng)后培養(yǎng)基置于4℃保存，待用［11］。

1.3.2紅曲酸奶的發(fā)酵工藝

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的全脂奶粉中，依次加入紅曲水提液、8%的蔗糖以及0.1%的復(fù)合穩(wěn)定劑，在無菌操作臺(tái)內(nèi)室溫水化2 h，充分溶解，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液分裝到滅菌瓶中，在90℃水浴保溫5min；待發(fā)酵液冷卻至37～43℃時(shí)，添加酸奶發(fā)酵劑，接種后不斷攪拌2 min，使菌種均勻分布于滅菌瓶中；43℃恒溫發(fā)酵，直至pH值為4.3～4.5，或滴定酸度在70～80°T；將滅菌瓶置于無菌操作臺(tái)冷卻至室溫，移入4℃冰箱中后熟12～24 h，即得紅曲酸奶［11］。

1.3.3熒光原位雜交法（FISH）實(shí)驗(yàn)

（1）熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)流程

取樣固定→酒精保存→細(xì)胞壁通透→探針雜交→制片→熒光鏡檢

（2）乳酸菌熒光鏡片制備

取100 μL待測酸乳液，置于1.5 mL離心管中，在10 000 r/min下離心5 min，去上清，收集沉淀；往收集的沉淀中加入10 μL 1×磷酸鹽緩沖液重懸，再加入30 μL 4%多聚甲醛，放入4℃冰箱靜置固定1 h；1 h后由冰箱取出離心管加入40 μL無水乙醇，在-20℃冰箱中儲(chǔ)存0.5 h以上；取8 μL上述菌液，加入42.5 μL 0.01 mo1/L Tris-HC1溶液和2.5 μL 20 mg/mL溶菌酶溶液，混合均勻；往離心管中加入20 μL 5×雜交液、22 μL去離子甲酰胺以及5 μL的EUB338探針（黑暗條件下加入，防止淬滅），輕輕重懸，置于46℃下雜交1 h；取雜交后的液體在0.2 μm聚碳酸酯濾膜上真空過濾，滴加12 μL抗熒光淬滅劑，封片。

（3）熒光鏡檢

將制得鏡片置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，藍(lán)色光激發(fā)熒光。隨機(jī)選取熒光顯微鏡內(nèi)觀察5個(gè)視野，取其平均數(shù)，菌體細(xì)胞數(shù)按照下列公式計(jì)算：

其中，因?qū)嶒?yàn)選用過濾半徑為8.4mm的聚碳酸酯濾膜，其過濾面積S=π×8 4002≈2.22×108μm2；觀察的視野面積為118×89.2=1.05×104μm2。

1.3.4酸奶的保藏期實(shí)驗(yàn)

將4℃冰箱中裝有制成紅曲酸奶的無菌瓶取出，無菌條件下進(jìn)行取樣操作，完成乳酸菌熒光鏡片制備。取樣時(shí)間［12］分別為1 d、2 d、7 d、8 d、11 d、12 d、13 d、14 d，取樣完成后將無菌瓶放回冰箱。

2　結(jié)果與分析

2.1FISH法觀察發(fā)酵過程中的乳酸菌

采用熒光原位雜交（FISH）法跟蹤酸奶發(fā)酵過程中的乳酸菌變化，跟蹤時(shí)間分別為1 h、3 h、5 h，通過熒光鏡檢圖片觀察發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)的變化，結(jié)果見圖1。

圖1　酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h乳酸菌數(shù)變化情況Fig.1 Change of lactic acid bacteria count of yogurt by fermentation for 1 h，3 h，5 h

圖1熒光視野中存在的兩種菌分別為長桿型保加利亞乳桿菌和球型嗜熱鏈球菌。其中圖1A、1C、1E為普通酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h FISH圖（稀釋倍數(shù)分為10、50、500倍）；圖1B、1D、1F為紅曲酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h FISH圖（稀釋倍數(shù)分為10、50、500倍）。由圖1可知，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，兩種酸奶中總?cè)樗峋鷶?shù)均呈上升趨勢。

2.2兩種酸奶發(fā)酵過程乳酸菌的變化對(duì)比

對(duì)發(fā)酵時(shí)間為0～6 h的普通酸奶和紅曲酸奶中的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1、表2。

表1　普通酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌體細(xì)胞對(duì)數(shù)值Table 1 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin normal yogurt

表2　紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌體細(xì)胞對(duì)數(shù)值Table 2 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin red kojic rice yogurt

綜合表1和表2可知，發(fā)酵1 h時(shí)，兩種酸奶所測定的菌數(shù)量基本不變。延滯期時(shí)，菌體的細(xì)胞數(shù)目變化緩慢，菌體分裂幾乎處在一個(gè)停止的狀態(tài)［13］，判斷此時(shí)球菌和桿菌處于延滯期，幾乎不生長。發(fā)酵2～3 h時(shí)，菌體細(xì)胞數(shù)目開始增加，此時(shí)嗜熱鏈球菌的增長速率快于保加利亞乳桿菌，菌體細(xì)胞數(shù)目更多，該時(shí)期嗜熱鏈球菌是主要的產(chǎn)酸菌株［14］，這一結(jié)果與郭本恒等［15］認(rèn)為的球菌率先進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的結(jié)論一致。

PUTTANANJAIAH M K H等［7］發(fā)現(xiàn)，紅曲提取物可以激活和提高β-半乳糖苷酶的活性，使體系內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸的速率增快，進(jìn)而促進(jìn)乳酸菌的生長。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)酵過程中兩種酸奶乳酸菌的菌量變化，發(fā)酵1 h時(shí)，兩種酸奶的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌數(shù)目基本相同，處于生長的延滯期。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，紅曲酸奶適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境所用的時(shí)間少，更早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，發(fā)酵2h時(shí)，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍。發(fā)酵5 h時(shí)，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。發(fā)酵全程，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量均高于普通酸奶。

2.3紅曲酸奶保藏期研究

分析統(tǒng)計(jì)紅曲酸奶發(fā)酵期間乳酸菌含量變化，以探究其保藏期，結(jié)果見表3。

表3　紅曲酸奶保藏期間乳酸菌變化情況Table 3 Changes of lactic acid bacteria in red kojic rice yogurt during shelf-life

從表3中可以看出，保藏期達(dá)15 d時(shí)，紅曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》對(duì)酸奶中活性乳酸菌含量的要求。因此可說明紅曲酸奶保藏期可達(dá)15 d。

3　結(jié)論

應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對(duì)酸奶中的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著高于普通酸奶。當(dāng)發(fā)酵2 h時(shí)，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍；發(fā)酵進(jìn)行至5 h，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。在發(fā)酵全部過程中，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量均多于普通酸奶，說明紅曲米浸提液對(duì)乳酸菌的生長有一定的促進(jìn)作用。經(jīng)保藏15 d，紅曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，滿足國標(biāo)相關(guān)要求，說明該紅曲酸奶保藏期可達(dá)15 d。

［1］王伯華，許楊，李燕萍.紅曲菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（29）：16147-16148.

［2］張曉敏，楊明.紅曲及其生物活性物質(zhì)的介紹［J］.肉類工業(yè)，2009 （12）：32-36.

［3］余煥玲，晏萍.乳酸菌的生理功能及在食品中的應(yīng)用［J］.飲料工業(yè)，2000，3（4）：10-13.

［4］CONDURSO C，VERZERAA A，ROMEO V，et a1.So1id-phase microextraction and gas chromatography mass spectrometry ana1ysis of dairy product vo1ati1es for the determination of she1f-1ife［J］.Int Dairy J，2008，18:819-825.

［5］TAMME A Y，ROBINSON R K.Yoghurt science and techno1ogy［M］. Cambridge:Woodhead Pub1ishing，2007.

［6］冀朵朵，張國亮，金蘇，等.開菲爾奶抑制腸道致病菌、降膽固醇及調(diào)節(jié)免疫功能研究［J］.中國乳品工業(yè)，2009，37（8）：4-8.

［7］PUTTANANJAIAH M K H，DHALE M A，GOVINDASWAMY V. Non-Toxic effect ofMonascus purpureusextract on 1actic acid bacteria suggested their app1ication in fermented foods［J］.Food Nutr Sci，2011，2（8）:837-843.

［8］REGAN J M，OLDENBURG P S，PARK H D，et a1.Simu1taneous determination of bacteria1 viabi1ity and identity in biofi1ms using ethidium monoazide and f1uorescent insitu hybridization［J］.Water Sci Technol，2003，47（5）:123-128.

［9］GARC A-CAYUELA T，TABASCO R，PELáEZ C，et a1.Simu1taneous detection and enumeration of viab1e 1actic acid bacteria and bifidobacteria in fermented mi1k by using propidium monoazide and rea1-time PCR ［J］.Int Dairy J，2009，19（6）:405-409.

［10］嵇豪，蔣冬花，楊葉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅曲米中水溶性色素［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，34（1）：91-96.

［11］肖昌貴，劉志彬，張雯，等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲酸奶的發(fā)酵工藝［J］.中國釀造，2014，33（4）：145-149.

［12］許謙.保存溫度對(duì)酸奶品質(zhì)及活性乳酸菌含量的影響［J］.微生物學(xué)雜志，2014（4）：67-70.

［13］陳世和，陳建華.微生物生理學(xué)原理［M］.上海：同濟(jì)大學(xué)出版社，1992.

［14］林偉鋒，劉宏鋒，趙謀明，等.酸奶發(fā)酵過程中物理性質(zhì)和乳酸菌生長規(guī)律研究［J］.中國乳品工業(yè)，2005，33（1）：15-18.

［15］郭本恒.乳品微生物學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.

Changes of 1actic acid bacteria in red kojic rice yogurt

WANG Zhiyao，XIAO Changgui，NI Li，ZHANG Wen，CHEN Zhichao，LIU Zhibin* （Institute of Food Science and Techno1ogy，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

The active ingredient of red kojic rice was extracted by u1trasound-assisted method and its water extract was mixed with who1e mi1k powder to ferment a nove1 red kojic rice yogurt.The changes of 1actic acid bacteria during the yogurt fermentation with or without red kojic rice extract were detected by f1uorescence in situ hybridization method.Resu1ts showed thatLactobaci11us bu1garicusandStreptococcus thermophi1uscount in red kojic rice yogurt was significant1y higher than that in norma1 yogurt，when the fermentation time was 2 h，the resu1ts indicated that the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.63 and 2.24 times of norma1 yogurt，respective1y.When fermentation time was 5 h，the process was c1osed to the end，and the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.29 and 2.75 times of those in the contro1，respective1y.The she1f 1ife of the red kojic rice yogurt cou1d reach 15 d and the 1actic acid bacteria count met the requirement of the nationa1 food safety standard of the fermented mi1k.

1actic acid bacteria；FISH；red kojic rice yogurt

TS201.3

A

0254-5071（2015）12-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.005

2015-10-10

國家自然科學(xué)基金（31371820，31171733）

王智耀（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

劉志彬（1982-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。