亓文靜，李 巖，王 玉，于愛(ài)蓮

(泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，山東泰安271000)

IL-2是免疫系統(tǒng)中多效能的細(xì)胞因子，對(duì)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞有激活作用［1］。IL-2在病毒性感染，惡性腫瘤和其他疾病中具有重要臨床價(jià)值。

巨噬細(xì)胞極化是一異質(zhì)過(guò)程，不同極化產(chǎn)生不同功能的活化細(xì)胞。根據(jù)表型和分泌的細(xì)胞因子，可將其激活分為經(jīng)典活化(classically-activated，M1)和選擇活化(alternatively-activated，M2)，不同活化誘導(dǎo)不同的胞內(nèi)信號(hào)。常見(jiàn)M1型標(biāo)志物:IFN-γ、IL-1β、IL-12、IL-23及 TNF-α 等;M2 型標(biāo)志物有:Arginase-1、CD163、IL-10、IL-4R1 及 TGF-β 等［2］。巨噬細(xì)胞極化是多因子相互作用的復(fù)雜過(guò)程，受到胞內(nèi)多種分子及通路的調(diào)控。

IL-2能夠有效激活、提高巨噬細(xì)胞的吞噬及殺傷活性［3-4］。但I(xiàn)L-2對(duì)巨噬細(xì)胞極化及其機(jī)制很少有報(bào)道。IL-2同家族的IL-4，已被證實(shí)能夠促使M0向M2極化［5］。因此，本研究擬通過(guò)與IL-4作用的對(duì)比，探求IL-2在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化中的作用及其所涉及的通路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));重組小鼠白介素-2(rmIL-2)和重組小鼠白介素-4(rmIL-4)(Sigma公司);Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-Green熒光染料［寶生物工程(大連)有限公司］;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成;蛋白裂解液RIPA、PMSF蛋白酶抑制劑和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);anti-F4/80-PE，anti-CD206-APC(eBbioscience)和 anti-CD11c-FITC(Biolegend)(達(dá)科為公司);anti-iNOS(sc-650)和anti-Arg-1(sc-20150)(Santa Cruz公司);anti-Phospho-Stat5(p-Stat5，#4322)，anti-Stat5(#9358)，anti-Phospho-Jak3(p-Jak5，#5031)，anti-Jak3(#8863)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cell Signaling Technology公司);ECL Plus發(fā)光液(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理:巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，0.05%胰蛋白酶消化傳代，傳至3～8代內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。重組細(xì)胞因子rmIL-2(IL-2)和rmIL-4(IL-4)對(duì)細(xì)胞的處理濃度均為20 ng/mL，對(duì)照組處理采用同樣濃度的BSA。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量real-time PCR:細(xì)胞經(jīng)處理后，Trizol法提取總 RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作，1 μg RNA反轉(zhuǎn)獲得 cDNA第一鏈。Real-time PCR SYBR Green試劑盒檢測(cè)各目的基因的mRNA水平，各基因引物序列見(jiàn)表1。檢測(cè)儀器為:ABI 7300 real-time PCR儀。反應(yīng)條件(二步法):95℃15 s，60 ℃ 45 s，45 循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù):RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)IL-2(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)處理24 h后，分別用F4/80-PE和 CD11c-FITC標(biāo)記 M1型細(xì)胞，以F4/80-PE和CD206-APC標(biāo)記M2型細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD Biosciences)檢測(cè)，以Cell Quest軟件分析10 000個(gè)細(xì)胞樣品。

1.2.4 Western blot:細(xì)胞處理完成后，消化收集各培養(yǎng)板細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗3次，加入適量預(yù)混PMSF的RIPA蛋白裂解液，冰浴裂解15 min，12 000 r/min離心10 min后取上清。BCA法蛋白定量，與適量比例的上樣緩沖液混合后，煮沸10 min。

等量蛋白(40 μg)上樣于12%SDS-PAGE膠中分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶粉封閉1～2 h后，4℃孵育一抗過(guò)夜，次日，TBST洗膜，10 min/次，共洗3次，常溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，TBST洗膜，10 min/次，共洗3次，化學(xué)發(fā)光底物(ECL Plus發(fā)光液)，曝光。Gel Pro Analyzer軟件處理?xiàng)l帶吸光度值。

表1 細(xì)胞因子引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences of oytokines

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析及作圖使用SPSS 18.0軟件及Graph-Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示。組間比較采用單因素方差分析或配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IL-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7表達(dá)M1型標(biāo)志分子表達(dá)上調(diào)

在IL-2處理組，IL-1β的mRNA水平隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)上調(diào)，在24 h表達(dá)量最高，而IL-10的mRNA水平在IL-2處理前后未發(fā)生改變(圖1A);在IL-4處理組，IL-10的mRNA水平隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸表達(dá)上調(diào)，而IL-1β的表達(dá)水平未出現(xiàn)顯著性差異(圖1B)。

IL-2和 IL-4誘導(dǎo)處理24 h后，TNF-α、IL-12和M2標(biāo)志性分子CD163表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-2能夠引起TNF-α和IL-12的mRNA水平分別升高16.36和6.63倍，而CD163表達(dá)未改變(圖2A);IL-4誘導(dǎo)引起了TNF-α和CD163 mRNA表達(dá)分別升高2.3倍和4.27倍(圖2B)。

圖3顯示，IL-2能夠引起M1型標(biāo)志分子iNOS蛋白水平顯著上調(diào)，而IL-4能夠上調(diào)M2型分子Arg-1的蛋白水平。

2.2 IL-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7向M1極化

IL-2處理后，M1型巨噬細(xì)胞比例上升到24.6%，顯著高于M2型的10.6%;與此相對(duì)應(yīng)，IL-4處理后，M2型巨噬細(xì)胞比例上升到26.8%，顯著高于M1型的9.4%(圖4)。提示:IL-2能夠體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7由M0向M1極化。

圖1 IL-2或IL-4作用RAW 264.7細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，IL-1β和IL-10的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)Fig 1 The mRNA levels of IL-1β and IL-10 in RAW 264.7 cells treated with IL-2 or IL-4 for indicated time points

圖2 IL-2或IL-4刺激RAW 264.7細(xì)胞24 h后，巨噬細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)志分子的mRNA表達(dá)水平Fig 2 The mRNA levels of M1 and M2 macrophages markers in RAW 264.7 cells after treated with IL-2 or IL-4 for 24 hours

圖3 IL-2或IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型標(biāo)志分子iNOS和M2型標(biāo)志分子Arg-1蛋白水平的檢測(cè)Fig 3 The protein levels of iNOS and Arg-1 were detected by Western blot

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW 264.7的分型Fig 4 The phenotype of macrophage RAW 264.7 were detected by Flow cytometry

2.3 IL-2通過(guò)激活Jak3-Stat5信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7極化

Western blot方法檢測(cè)Jak3和Stat5的磷酸化及總的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，在IL-2處理后，Jak3和Stat5分子的磷酸化水平分別增高3.2和2.6倍(P＜0.01)，而其總蛋白水平?jīng)]有改變(圖5)。提示:Jak3-Stat5信號(hào)可能通路參與了IL-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1型極化作用。

3 討論

巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要成分，在機(jī)體的炎性反應(yīng)、代謝及腫瘤微環(huán)境形成等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是針對(duì)不同環(huán)境因子產(chǎn)生的應(yīng)答機(jī)制。巨噬細(xì)胞存在M1和M2兩種極化類型［6］，M1型細(xì)胞表現(xiàn)為促炎性反應(yīng)和抗原提呈作用等，而M2型主要存在于腫瘤微環(huán)境中，主要抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和纖維化等［7］。研究表明，IL-2可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，IL-1和NO等細(xì)胞因子，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)病原微生物或腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［4］。然而，關(guān)于IL-2對(duì)巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)及其機(jī)制，至今尚未明確。

圖5 Western blot檢測(cè)IL-2對(duì)Jak3-Stat5信號(hào)通路激活Fig 5 The effects of IL-2 on Jak3-Stat5 signaling pathway were detected by Western blot

原始RAW 264.7細(xì)胞通常被認(rèn)作M0型巨噬細(xì)胞。經(jīng)IL-4作用，M0被誘導(dǎo)為M2［5］;而經(jīng) LPS刺激，M0極化為M1［8］。本研究采用重組IL-2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-2能夠上調(diào)表達(dá)M1型標(biāo)志分子的表達(dá)，而對(duì)M2型標(biāo)志分子的表達(dá)無(wú)影響;之后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)，IL-2能夠誘導(dǎo)M0向M1極化。結(jié)果顯示，相比于IL-4可誘導(dǎo)分泌M2型標(biāo)志性分子，IL-2能夠體外誘導(dǎo)M1型標(biāo)志分子。再者，最新研究證明，IL-2能夠促使IFN-γ的合成與分泌，IFN-γ 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向 M1型極化［9］，亦間接證實(shí)本研究結(jié)果。

巨噬細(xì)胞極化是多因子多通路共同調(diào)控的結(jié)果，目前對(duì)其極性轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制仍未完全明確。有研究指出，IL-4能夠通過(guò)激活Jak-Stat6通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化及相關(guān)標(biāo)志分子的誘導(dǎo)［10］。IL-2及其受體γ是Jak3信號(hào)通路激活的基本條件;敲除IL-2受體γ即可阻滯其下游Stat5和MAPK等分子的磷酸化及表達(dá)［11］。作為Stat5的眾多配體之一，IL-2能夠在Tyr694位點(diǎn)使Stat5磷酸化，繼而促使其激活［12］;再者，在人DC細(xì)胞中，IL-2能夠上調(diào)p-Stat5［9］。因此，本研究選擇檢測(cè)IL-2作用后Jak3和Stat5的活化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-2作用后，Jak3和Stat5總蛋白水平?jīng)]有改變，而其磷酸化水平顯著提高，提示IL-2能夠激活Jak3-Stat5通路。

本實(shí)驗(yàn)報(bào)道了IL-2具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M0向M1型極化的功能，并初步探究IL-2可能是通過(guò)Jak3-Stat5信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控。從而將為繼續(xù)研究IL-2的功能多樣性，或深入探討巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，增添新的研究資料和研究思路，同時(shí)也為機(jī)體免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供重要參考價(jià)值。

［1］Skrombolas D，F(xiàn)relinger JG．Challenges and developing solutions for increasing the benefits of IL-2 treatment in tumor therapy［J］． ExpertRev Clin Immunol，2014，10:207-217．

［2］ Van Ginderachter JA，Movahedi K，Hassanzadeh Ghassabeh G，et al．Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes:picking the best of both worlds for tumorpromotion ［J］． Immunobiology， 2006， 211:487-501．

［3］曹雪濤．白細(xì)胞介素2的基礎(chǔ)與臨床［M］．北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，1990，90-93．

［4］邱實(shí)，閔志廉，雷虹，等．IL-2基因修飾對(duì)巨噬細(xì)胞殺瘤活性的影響［J］．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21:24-26．

［5］Stein M，Keshav S，Harris N，et al．Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity:a marker of alternative immunologic macrophage activation［J］．J Exp Med，1992，176:287-292．

［6］Mosser DM，Edwards JP．Exploring the full spectrum of macrophage activation［J］．Nat Rev Immunol，2008，8:958-969．

［7］Gordon S，Martinez FO．Alternative activation of macrophages:mechanism and functions［J］．Immunity，2010，32:593-604．

［8］楊琴，張志仁，姜曼，等．小鼠巨噬細(xì)胞功能極化可塑性的初步探討［J］．免疫學(xué)雜志，2013，29:104-109．

［9］Herr F，Lemoine R，Gouilleux F，et al．IL-2 phosphorylates STAT5 to drive IFN-γ production and activation of human dendriticcells［J］． JImmunol， 2014， 192:5660-5670．

［10］Martinez FO，Helming L，Gordon S．Alternative activation of macrophages:an immunologic functional perspective［J］．Annu Rev Immunol，2009，27:451-483．

［11］Agarwal A，MacKenzie RJ，Eide CA，et al．Functional RNAi screen targeting cytokine and growth factor receptors reveals oncorequisite role for interleukin-2 gamma receptor in JAK3-mutation-positive leukemia［J］． Oncogene，2014，doi:10．1038/onc．2014．243．

［12］ Okutani Y，Kitanaka A，Tanaka T，et al．Src directly tyrosine-phosphorylates STAT5 on its activation site and is involved in erythropoietin-induced signaling pathway［J］．Oncogene，2001，20:6643-6650．