馬 玲，周 勇，王 莉，姚 華

(新疆醫(yī)科大學1.公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室;2.基礎醫(yī)學院生物學教研室，新疆烏魯木齊830011;3.北京市東城區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務管理中心，北京100701;4.新疆醫(yī)科大學新疆重大疾病醫(yī)學重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，新疆烏魯木齊830011)

隨著尿酸與心血管之間關系的深入研究，高尿酸血癥是否為心血管疾病的獨立危險因素的爭議不斷。體外培養(yǎng)發(fā)現尿酸可導致血管內皮細胞炎性反應和功能障礙［1-2］。目前認為高尿酸導致的內皮細胞炎性反應與氧化應激有關。高尿酸血癥大鼠體內的抗氧化能力下降［3］。α-硫辛酸 (Alpha-lipoic acid，α-LA)是線粒體酶系復合物的一種輔助因子，能夠抑制脂質過氧化、清除氧自由基、恢復和增加體內其他抗氧化劑水平，從而減弱氧化應激、降低炎性標志物水平和改善內皮細胞功能［4］。本研究通過動物實驗觀察α-硫辛酸對高尿酸血癥大鼠體內氧化應激水平和血管內皮細胞形態(tài)的影響，為進行此類疾病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

酵母(97%)和β-actin(Sigma公司)，氧嗪酸鉀(OA)(OXOID公司)，α-LA(江蘇神龍藥業(yè)有限公司)，超氧歧化物酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)試劑盒(為南京建成生物工程研究所)，SOD一抗和二抗(Santa公司)，CAT一抗(Epitomics公司)，CAT二抗(北京中杉金橋公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質量(200±35)g［新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號:SYXK(新)2003-0004］。隨機分為對照組、模型組、α-LA低劑量組(LLA組)、α-LA中劑量組(MLA組)和α-LA高劑量組(HLA組)，每組12只。對照組給予普通飼料喂飼，模型組和α-LA干預組參照文獻［3］進行高尿酸血癥大鼠造模，3周后在持續(xù)造模的基礎上，每天分別給予10、30和90 mg/kg的α-硫辛酸灌胃，連續(xù)2周。實驗期間，動物自由攝食和飲水。

1.3 樣本收集與指標檢測

1.3.1 樣本收集:干預2周后，烏拉坦腹腔麻醉，經腹主動脈取血，取胸主動脈，0.9%氯化鈉溶液沖洗后，去近心端約1 cm，一段放入甲醛小瓶中固定，病理HE染色切片觀察、一段放入已編號的盛有2.5%戊二醛小瓶中固定，電鏡觀察超微結構，剩余部分－80℃保存?zhèn)溆玫鞍诇y定。

1.3.2 指標檢測:生化法檢測血清尿酸(UA)，試劑盒檢測血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA水平。

1.3.3 Western blot:檢測大鼠胸主動脈SOD、CAT蛋白:RlPA提取細胞蛋白，并用BCA法測定蛋白濃度。根據所測得濃度調整上樣量，使每孔蛋白上樣量均為40 μg，依次進行電泳、轉膜、封閉、雜交和顯影，掃描片子后用Quantity One軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用軟件SPSS17.0對數據進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差±s)表示。多組之間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析;兩兩比較時，方差齊，進行SNK檢驗(Student-Newman-Keuls);方差不齊，進行Games-Howell檢驗。

2 結果

2.1 α-LA干預前后各組大鼠血清尿酸水平比較

干預前，模型組和α-硫辛酸干預組的血清尿酸水平均高于對照組(P＜0.05);干預后，各劑量干預組血清尿酸水平低于模型組(P＜0.05)(表1)。

2.2 α-LA干預后各組大鼠血清抗氧化酶活力的比較

模型組的SOD、GSH-Px和CAT酶活力均低于對照組，MDA含量高于對照組(P＜0.05)。α-硫辛酸干預后，高、中和低劑量組MDA含量低于模型組，中劑量和高劑量組SOD酶活力高于模型組(P＜0.05)(表2)。

表1 各組大鼠α-LA干預前后的血清尿酸水平比較Table 1 Comparison of serum uric acid in hyperuricemia rats before and after intervention of α-lipoic acid(n=12± s，mmol/L)

表1 各組大鼠α-LA干預前后的血清尿酸水平比較Table 1 Comparison of serum uric acid in hyperuricemia rats before and after intervention of α-lipoic acid(n=12± s，mmol/L)

#P＜0.05 compared with control group;*P＜0.05 compared with model group．

group before intervention after intervention normal control 76.3±19.3* 65.0±23.3*model 127.4±18.0# 123.2±29.3#LLA 124.7±25.2# 59.5±29.5*MLA 123.5±24.2# 47.8±18.3*HLA 151.5±26.9# 31.7±21.3*

2.3 α-LA干預后各組大鼠胸主動脈SOD、CAT蛋白表達

模型組的SOD和CAT蛋白表達水平均顯著低于正常對照組(P＜0.05)(圖1，2)。

LLA、MLA、HLA組SOD吸光度值均高于模型組;MLA、HLA組CAT吸光度值均高于模型組(P＜0.05)(表3)。

圖1 各組大鼠胸主動脈SOD蛋白表達水平Fig 1 SOD's protein expression of rat's thoracic aorta in different groups(Western blot)

圖2 各組大鼠胸主動脈CAT蛋白表達水平Fig 2 CAT's protein expression of rat's thoracic aorta in different groups(Western blot)

2.4 α-LA干預后大鼠胸主動脈的病理改變

正常對照組大鼠的胸主動脈壁內膜表面光滑、完整、各層結構正常，內皮細胞排列緊密無脫落，少見炎性細胞黏附、浸潤。模型組可見大鼠部分內皮細胞水腫、脫落，內膜凸起;干預高劑量組大鼠胸主動脈內皮水腫、凸起數量減少(圖3)。

2.5 干預后大鼠胸主動脈超微結構的改變

正常對照組:內膜表面光滑，內皮細胞多扁平，可見細胞核，染色質較均勻。中膜彈性膜連續(xù)，層次清楚。平滑肌細胞單層排列，核多見。模型組:內皮細胞水腫或脫落，細胞核基質密度增大。內彈力膜較厚，部分區(qū)域斷裂、缺失。平滑肌細胞層，寬窄不一，多見“多支性平滑肌細胞”，平滑肌細胞向腔內移。線粒體腫脹，密度增大(圖4)。

LLA組:內皮細胞腫脹明顯，內皮細胞與內皮細胞下層連接不緊密，形成較大空泡。內皮基質密度較模型組有下降。細胞核異染色質較多，線粒體較多。MLA組:內皮細胞水腫程度較LLA組輕。中膜彈力層線粒體腫脹，數量增多。細胞核異染色質較多，平滑肌細胞層不連續(xù)。HLA組:內皮細胞水腫減輕，線粒體數量減少，內彈力膜連續(xù)。平滑肌線粒體水腫減輕(圖5)。

表2 各組大鼠α-LA干預后血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的影響Table 2 Comparison of serum SOD，GSH-Px，CAT and MDA in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12，mmol/L)

表2 各組大鼠α-LA干預后血清SOD、GSH-Px、CAT和MDA的影響Table 2 Comparison of serum SOD，GSH-Px，CAT and MDA in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12，mmol/L)

#P＜0.05 compared with control group;*P＜0.05 compared with model group．

?

表3 各組大鼠α-LA干預后胸主動脈SOD、CAT蛋白表達值Table 3 Comparison of expression of SOD and CAT protein in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12±s)

表3 各組大鼠α-LA干預后胸主動脈SOD、CAT蛋白表達值Table 3 Comparison of expression of SOD and CAT protein in hyperuricemia rats after the intervention of α-lipoic acid(n=12±s)

#P＜0.05compared with control group;*P＜0.05compared with model group．

group SOD CAT normal control 0.5378±0.0789* 0.5875±0.0441*model 0.2425±0.0464# 0.1952±0.0229#LLA 0.3278±0.0397#* 0.2448±0.0292#MLA 0.3727±0.0425#* 0.5728±0.0506*HLA 0.4249±0.0393#* 0.5966±0.0577*

3 討論

本實驗發(fā)現高尿酸血癥大鼠進行α-硫辛酸干預后，血清尿酸水平均顯著降低，提示α-硫辛酸干預有效。若延長給藥時間，是否趨于穩(wěn)定，還有待進一步研究。

血管內皮功能紊亂涉及多種病理、生理機制，氧化應激可能是內皮細胞損傷的主要機制之一［5］。當血清尿酸水平＞380 μmol/L時，氧化應激可能導致血管內皮功能障礙［6］。本研究發(fā)現α-LA干預后，MDA含量降低，SOD活力升高，并且 SOD和CAT蛋白表達也顯著增高，提示α-LA增加抗氧化能力。但各組大鼠血清中CAT和GSH-Px活性無顯著性變化，可能由于灌胃給藥方法的首過效應降低了α-LA的生物利用率，另外不排除由于樣本量所造成的第二類錯誤。

研究報道尿酸誘導的內皮細胞功能紊亂與線粒體損傷及細胞內ATP產生減少有關［7］。本研究通過光鏡未觀察到高尿酸血癥大鼠血管形態(tài)學的差異，但電鏡發(fā)現模型大鼠的胸主動脈內皮細胞水腫或脫落，提示高尿酸血癥大鼠體內抗氧化能力下降，出現氧化應激損傷。為保證內皮細胞正常功能，線粒體數目在早期出現代償性的增加，后由于α-LA干預，適度緩解了線粒體的氧化應激損傷，使線粒體代償性增加的趨勢得到控制，線粒體數目先增加后減少，從而出現線粒體一過性增加。近年來關于高尿酸血癥血管內皮細胞超微結構的鮮有研究，本研究提示線粒體的改變對HUA的致病機制有重要意義。但此次實驗未能對血管彈性以及血管內皮功能相關指標進行檢測，還需在今后的研究中予以補充。

圖3 光鏡下大鼠胸主動脈病理改變Fig 3 Pathological alteration of rat's thoracic aorta nuder microscope(HE×400)

圖4 電鏡下大鼠胸主動脈超微結構Fig 4 Ultrastruction of rat's thoracic aorta under electron microscope

圖5 電鏡下不同劑量的α-硫辛酸干預組的大鼠胸主動脈超微結構Fig 5 Ultrastruction of rat's thoracic aorta under electron microscope in different groups ofα-lipoic acid intervention

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［4］王莉，馬玲，姚華，等．單純酵母喂飼和氧嗪酸聯合酵母暴露高尿酸血癥腎病大鼠模型的建立及其抗氧化活力變化的比較研究［J］．環(huán)境與健康雜志，2012，29:612-614．

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