趙忠桂， 劉 霜， 劉艷華， 李雅欣， 伍愛(ài)榮，周業(yè)成

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，湖南 衡陽(yáng)421001)

MDMA(3，4-methylenedioxy-methamphetamine)，又名3，4 亞甲基二氧甲基苯丙胺，屬于苯丙胺類興奮劑，化學(xué)式:C11H15NO2. 小鼠經(jīng)口灌胃LD50為27.35mg/kg.bw.MDMA 是一種化學(xué)合成毒品"搖頭丸"的主要成分，具有中樞神經(jīng)興奮和致幻作用.該藥物能使大腦快速釋放出大量的血清素，讓使用者感到精力充沛、興奮無(wú)比和身心愉悅. 國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)資料表明［1-4］:MDMA 可引起幻覺(jué)、幻視、眩暈、空間定向力障礙，最初感受有頭暈，口干，出汗等;引起中毒劑量時(shí)可有高熱，大汗，心率增快，呼吸加快，血壓升高，亢奮，肌肉緊張，視物模糊，甚至驚厥發(fā)作，還有學(xué)習(xí)和記憶的缺損. 嚴(yán)重時(shí)可致腦水腫，中毒性肝炎，高熱，低鈉血癥，DIC，急性腎衰，猝死.患者服用后自我約束力下降，甚至出現(xiàn)暴力傾向，具有很大的社會(huì)危害性. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面，有關(guān)研究表明［5-8］:MDMA 對(duì)大鼠及小鼠神經(jīng)及情緒均有一定的影響作用.毒品濫用與自然生態(tài)環(huán)境也有著密切關(guān)系，如:首先毒品種植過(guò)程中容易導(dǎo)致樹(shù)木毀壞、土壤流失，使用的殺蟲(chóng)劑、化肥等影響生態(tài)，其次毒品加工過(guò)程中使用的化學(xué)物質(zhì)殘留可造成河水污染，不僅影響水生生態(tài)環(huán)境，而且危害著居民的身體健康，因此研究新型毒品MDMA 的遺傳毒性具有一定理論及實(shí)際意義.但有關(guān)MDMA 對(duì)動(dòng)物及人類生殖系統(tǒng)遺傳物質(zhì)的損傷研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道.前期本課題組已做過(guò)相關(guān)研究，結(jié)果表明MDMA 在實(shí)驗(yàn)劑量?jī)?nèi)對(duì)小鼠睪丸組織細(xì)胞DNA 有一定損傷作用［9］.該研究進(jìn)一步探討MDMA 對(duì)雄性小鼠睪丸細(xì)胞微核率及染色體畸變率的影響，進(jìn)一步探究其對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞的遺傳毒性.

1 材 料

1.1 清潔級(jí)昆明種小鼠

南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):967)

1.2 受試物

MDMA (樣本粒重0.25 g，純度為55%)，由衡陽(yáng)市公安局禁毒中心提供

1.3 動(dòng)物處理

選用雄性小鼠80 只，7 ～9周齡，體重18 ～20 g，隨機(jī)分為4 組，每組20 只.設(shè)計(jì)MDMA 三個(gè)劑量組及一個(gè)陰性對(duì)照組，常規(guī)喂養(yǎng)一周后開(kāi)始染毒. MDMA 三個(gè)劑量組劑量分別為:低劑量組5.0 mg/kg、中 劑 量 組10. 0 mg/kg、高 劑 量 組20.0 mg/kg，陰性對(duì)照組采用生理鹽水，灌胃染毒20 d，每日1 次. 飼養(yǎng)條件:室溫約24 ℃，濕度約60%，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水.

2 方 法

2.1 微核試驗(yàn)

于染毒20 d 后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸，制備睪丸細(xì)胞單細(xì)胞懸液. 采用常規(guī)微核實(shí)驗(yàn)法.操作步驟:制片→甲醇固定15 min →取出晾干→10%新鮮配制的Giemsa 染色10 ～15 min →沖洗染液→晾干→雙盲法閱片.先用低倍鏡下選擇好分布均勻，染色較好的區(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)，PCE 細(xì)胞呈灰藍(lán)色，細(xì)胞中含有的微核多數(shù)呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色.一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)微核. 每組觀察10 000個(gè)睪丸組織細(xì)胞，記錄出現(xiàn)的微核細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其微核率(‰).

2.2 染色體畸變?cè)囼?yàn)

每組隨機(jī)取雄性小鼠各10 只，在取樣前4 小時(shí)腹腔注射秋水仙素(4.0 mg/kg·bw). 脫頸椎處死動(dòng)物后，取出睪丸，制備睪丸細(xì)胞單細(xì)胞懸液備用.再按照以下操作步驟進(jìn)行:離心(1 000 ～1 500 r/min，10 min)→0.075 mol/L KCl(4 mL)低滲處理→甲醇-冰乙酸固定液(2∶1)4 mL 固定2 次→制作標(biāo)本片→染色(10%吉姆薩)→鏡檢(油鏡雙盲法)，每個(gè)試驗(yàn)組觀察至少300個(gè)中期分裂相好的細(xì)胞染色體，并記錄所出現(xiàn)的染色體畸變細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算畸變率(%).

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

微核試驗(yàn)與染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果均采用SPSS13.0 軟件系統(tǒng)處理. 采用χ2檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為a=0.05.

3 結(jié) 果

3.1 微核試驗(yàn)結(jié)果

圖1 正常細(xì)胞無(wú)微核出現(xiàn)，圖2 細(xì)胞中出現(xiàn)單個(gè)微核.從表1 可以看出:總體微核率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)=299.84 P ＜0.01)，差異有顯著性;各劑量組分別與陰性組比較，其中高劑量組與陰性對(duì)照組差異有顯著性=0.139，P ＞0.5;=20.377，P ＞0.25;.146，P ＜0.01).各劑量組之間微核率的比較，其中高劑量組與低劑量比較之間，差異具有顯著性(=17. 383，P ＞0. 5;=38. 243，P ＜0.01=4.588 3，P ＞0.5). 因此該結(jié)果表明:MDMA 高劑量能誘導(dǎo)小鼠睪丸組織細(xì)胞微核率增加.

圖1 正常細(xì)胞(放大倍數(shù):400 ×)Fig.1 Normal cells(Magnification:400 ×)

圖2 微核細(xì)胞(放大倍數(shù):400 ×)Fig.2 Micronucleus cells(Magnification:400 ×)

表1 小鼠睪丸組織細(xì)胞微核情況Tab. 1 Testis cell micronucleus of the rats

3.2 染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

圖3 為染色體斷裂，圖4 中可見(jiàn)環(huán)狀染色體.從表2 中可看出:四組試驗(yàn)結(jié)果中總體染色體畸變率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，總體差異有顯著性(P ＜0. 01). 其中MDMA 高劑量組的染色體畸變率為4.39%，中劑量組的染色體畸變率為2. 34%，且與陰性對(duì)照組比較，差異有顯著性(P ＜0.05)，低劑量組畸變率與陰性組比較，差異無(wú)顯著性(P ＞0.05).. 染色體畸變率隨劑量的增加而增加，存在著劑量-效應(yīng)關(guān)系(r =0.850 0).，該試驗(yàn)結(jié)果顯示MDMA 在本次研究劑量?jī)?nèi)能誘導(dǎo)小鼠睪丸細(xì)胞染色體畸變率增加.

圖3 染色體斷裂(放大倍數(shù):1000 ×)Fig.3 Chromosome breakage (Magnification:1000 ×)

圖4 環(huán)狀染色體(放大倍數(shù):1000 ×)Fig.4 Ring chromosome(Magnification:400 ×)

表2 小鼠睪丸細(xì)胞染色體畸變率情況Tab.2 Chromosome aberrations of rats’Testicular cells

4 討 論

微核試驗(yàn)與染色體畸變?cè)囼?yàn)均為遺傳毒性的常用方法.微核實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)染色體損傷的基本方法，微核是染色體畸變?cè)陂g期細(xì)胞中的一種特殊表現(xiàn)，這些斷片或染色體在分裂過(guò)程中行動(dòng)滯后，在分裂末期不能進(jìn)入主核，便形成了主核之外的微核.微核往往是各種理化因子對(duì)分裂細(xì)胞作用而產(chǎn)生的，微核測(cè)試用于輻射損傷、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、食品添加劑的安全評(píng)價(jià)，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個(gè)方面. 如果與對(duì)照組比較，處理組PCE 微核率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，則可認(rèn)為該受試物是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的致突變物.微核試驗(yàn)在遺傳毒性和職業(yè)暴露人群遺傳損害監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)生態(tài)環(huán)境檢測(cè)方面，在診斷和預(yù)防肝癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤方面得到了大量的應(yīng)用.是直觀有效可行的方法，在遺傳毒理、醫(yī)學(xué)、食品、藥物、環(huán)境等諸多方面得到了廣泛的應(yīng)用，該試驗(yàn)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、輻射損傷、藥物篩選及血液學(xué)研究［8］.染色體畸變?cè)囼?yàn)是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)影響染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的基本方法，染色體畸變的原理是間期細(xì)胞經(jīng)過(guò)秋水仙素處理后，再進(jìn)行低滲、固定，即可在顯微鏡下觀察到良好的中期染色體分裂相，當(dāng)有害物質(zhì)作用于機(jī)體時(shí)，可引起細(xì)胞染色體的損傷.當(dāng)理化物質(zhì)作用于細(xì)胞周期G1期和S 期時(shí)，誘發(fā)染色體型畸變，而作用于G2期時(shí)則誘發(fā)染色體單體型畸變. 染色體結(jié)構(gòu)畸變類型很多，如斷裂、環(huán)狀染色體、單體互換、雙微小體、裂隙、粉碎化、著絲點(diǎn)細(xì)長(zhǎng)化、粘著等. 微核試驗(yàn)與染色體畸變?cè)囼?yàn)均有遺傳物質(zhì)損傷具有一定的相關(guān)性.

MDMA 是一種近年來(lái)濫用的精神活性物質(zhì)之一，MDMA 作為一種新型毒品，很受廣大不良少年親睞，嚴(yán)重影響社會(huì)生態(tài)環(huán)境，如①神經(jīng)系統(tǒng)損害:主要對(duì)視覺(jué)和語(yǔ)音及記憶方面呈現(xiàn)明顯的損害，與此同時(shí)，多伴有肌張力增高、腱反射亢進(jìn)、震顫等體征.②腎功能衰竭:MDMA 可引起高熱，課導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血、肌紅蛋白增加、橫紋肌溶解等從而致急性腎功能衰竭. ③肝臟毒性:如脂肪變性、黃疸、肝功能損害等.④社會(huì)生態(tài)問(wèn)題:搖頭丸易引起性病、艾滋病，且禍及家庭，危害生命與社會(huì)治安等.⑤戒斷反應(yīng):MDMA 易產(chǎn)生依賴，停藥后會(huì)出現(xiàn)戒斷癥狀，主要表現(xiàn)為情緒低落、抑郁、躁狂等.2014年國(guó)際禁毒日主題是遠(yuǎn)離毒品、健康生活、擁抱美好人生.毒品的泛濫不僅危害人民的身心健康，同時(shí)給經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步帶來(lái)巨大威脅.日趨嚴(yán)重的毒品問(wèn)題已成為全球性的災(zāi)難. 據(jù)美國(guó)國(guó)家地理網(wǎng)站報(bào)道，毒品生產(chǎn)及其相關(guān)過(guò)程對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞不容忽視.如搖頭丸生產(chǎn)及制備環(huán)節(jié)帶來(lái)大量的毒垃圾和難以負(fù)擔(dān)的森林危害，加工過(guò)程中產(chǎn)生的煙霧嚴(yán)重影響呼吸道健康，而且會(huì)給周圍區(qū)域造成巨大危害;大麻及可卡因等種植過(guò)程消耗大量電力能源，對(duì)環(huán)境破壞極大. 據(jù)聯(lián)合國(guó)毒品與犯罪問(wèn)題辦公室估計(jì)，可卡因的生產(chǎn)加速哥倫比亞、秘魯和玻利維亞的雨林被毀的進(jìn)程，而海洛因耗費(fèi)土地和燃料，全球市場(chǎng)對(duì)海洛因和其他鴉片劑的需求，加速了森林砍伐，阿富汗和東南亞的農(nóng)民把森林砍伐一空，用來(lái)種植罌粟. 與古柯種植一樣，罌粟很快就會(huì)耗盡森林土壤的養(yǎng)分，迫使種植者砍伐和燒毀新林區(qū)，海洛因生產(chǎn)帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)種植罌粟.提煉從罌粟里提取的乳狀汁液，把它制成海洛因，需要使用石灰、氨水、丙酮和鹽酸等有毒物質(zhì).這一過(guò)程通常是在密林中進(jìn)行的，這些有毒物質(zhì)最終會(huì)被丟棄，或者滲入排水渠，造成間接水污染. 資料顯示［10］我國(guó)的禁毒形勢(shì)非常嚴(yán)峻，境外毒品滲透加劇、境內(nèi)制販毒活動(dòng)猖獗、制毒原料走私流失突出、吸毒群體不斷擴(kuò)大. 要根除毒品危害，必須深化國(guó)際合作，從源頭上遏制毒品的滲透.

5 結(jié) 論

研究得出:MDMA 高劑量能誘導(dǎo)小鼠睪丸組織細(xì)胞微核率增加，中劑量組及高劑量組能使小鼠睪丸細(xì)胞染色體畸變率增高，結(jié)合研究組其他研究結(jié)果提示MDMA 對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)遺傳物質(zhì)有一定的損傷效應(yīng). 研究不僅具有理論研究意義，同時(shí)可為臨床上MDMA 對(duì)人類生殖健康影響提供一定的參考依據(jù)，為MDMA 引起的相關(guān)疾病預(yù)防與治療提供新的思路，同時(shí)為MDMA 服用者提供正確的生育指導(dǎo)，提高生育質(zhì)量，減少出生畸形.

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