高彥琳，陳厚良，張寧坤，高連如，朱智明△

Apelin-13促進臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞分化成血管網(wǎng)

高彥琳1，陳厚良2，張寧坤2，高連如2，朱智明1△

目的 探索apelin-13對干細胞定向血管網(wǎng)分化的調(diào)控作用。方法 采用組織塊貼壁法從人臍帶華通膠組織中分離間充質(zhì)干細胞，流式細胞儀檢測其免疫表型。取第3代人華通膠間充質(zhì)干細胞，分別接種于4個培養(yǎng)瓶中，記為A1、A2、A3、A4組，用誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7 d，每天向4組中分別加入濃度0、1×10-6、10×10-6、100×10-6mol/L的apelin-13 20 μL，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，并對其進行血管性血友病因子（vWF）抗體免疫熒光染色及CD31流式細胞學(xué)鑒定。使用水凝膠的三維培養(yǎng)基對誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細胞進行培養(yǎng)，并按照原A1、A2、A3、A4組的順序重新依次編號為S1、S2、S3、S4組。每天分別向S1、S2、S3、S4組中加入濃度0、1×10-6、10×10-6、100×10-6mol/L 的apelin-13 20 μL。7 d后倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)、生長情況及在三維培養(yǎng)基中形成血管樣結(jié)構(gòu)情況。結(jié)果 人華通膠間充質(zhì)干細胞可以誘導(dǎo)分化為vWF免疫熒光染色陽性的內(nèi)皮樣細胞。隨著apelin-13蛋白濃度的增加，CD31陽性表達率也隨之升高。顯微鏡下觀察到內(nèi)皮樣細胞在水凝膠的三維培養(yǎng)基中能夠形成血管樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論 證實apelin-13參與并調(diào)控人臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞分化形成血管網(wǎng)。

間充質(zhì)干細胞；apelin-13；血管生成；三維培養(yǎng)，臍帶

近50年來臨床心血管醫(yī)學(xué)積累了很多經(jīng)驗，但仍不能從根本上解決血管再生問題［1］。目前用于再生醫(yī)學(xué)的種子細胞主要包括胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是一種全能干細胞，但是在獲取胚胎干細胞的過程中需要破壞囊胚，存在倫理學(xué)爭議，并且將其移植入個體后會引起免疫排斥并導(dǎo)致畸胎瘤，限制了其臨床應(yīng)用［2］。隨后研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞不存在以上問題，并且自我更新能力強，具有多向分化潛能［3］。目前已從骨髓、脂肪、羊膜、胎盤、臍血以及臍帶等組織中分離出間充質(zhì)干細胞，其中臍帶來源廣泛，取材方便，易于收集、保存、冷凍，不受倫理、道德及法律方面的限制［4］。因此，臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞（WJ-MSCs）可作為理想的種子細胞。

Apelin是1998年立元等從牛胃中分離提取的活性多肽，主要由12、13、17和36多種分子活性形式組成［5］，其中apelin-13主要作用于心血管系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)血壓、體液平衡、血管形成等方面。在體外，apelin-13雖然不能促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞有絲分裂，但是對其有趨化作用，異位apelin-13表達可以引發(fā)新生血管的產(chǎn)生。然而，apelin-13是否可調(diào)控干細胞向血管分化至今尚少見報道。本實驗在體外，通過外源添加apelin-13蛋白研究其是否可調(diào)控誘導(dǎo)干細胞向血管內(nèi)皮細胞定向分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；apelin-13購自美國Santa Cruz公司；血管性血友病因子（vWF）抗體購自美國Sigma公司；EBM-2購自美國Lonza公司；流式單抗CD31-PE、CD45-FITC、CD309-PE、CD34-FITC、CD90-PE、CD105-PE、HLA-ABC-PE、HLA-DR-FITC購自美國Biolegend公司；倒置相差顯微鏡購自日本NIKON公司；流式細胞儀購自美國BD公司；紫外分光光度儀、CO2培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）的分離及培養(yǎng) 在經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且征得產(chǎn)婦和家屬書面知情同意的情況下，在海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)房取當(dāng)日剖宮產(chǎn)健康足月生產(chǎn)的新生兒臍帶（乙型肝炎病毒、丙肝病毒感染、人類免疫缺陷病毒、巨細胞病毒梅毒、艾滋病等傳染性疾病檢測陰性）。將無菌條件下獲取的臍帶放入無菌生理鹽水中，1 h內(nèi)送至細胞培養(yǎng)實驗室。用生理鹽水反復(fù)沖洗，洗去臍帶殘留血液。將臍帶剪成3～4 cm的小段，每段均沿臍靜脈腔剪開，平鋪后剔除靜脈，再剔除2根動脈，取出血管之間、血管與外膜之間的膠狀物——華通膠，用小剪刀將取出的華通膠反復(fù)剪切成≤1 mm3小塊，接種于T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶內(nèi)加入10 mL含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，使臍帶華通膠均勻分布瓶底，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細胞生長增殖情況并拍照。待細胞生長至80%～90%融合狀態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞，記為第1代細胞（P1）。

1.2.2 hUC-MSCs表面標志物檢測 取第3代對數(shù)生長期的hUC-MSCs，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗2次，將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL單細胞懸液，每個EP管加100 μL細胞懸液，每種抗體設(shè)置1個復(fù)管。分別加入鼠抗人單克隆抗體PE-CD90、PE-CD105、PE-CD31、PE-CD309、PE-HLA-ABC、FITC-CD45、FITC-CD34、FITC-HLA-DR各20 μL，充分混勻，避光室溫孵育30 min，PBS洗2遍（250×g離心5 min），重新制成細胞懸液0.5 mL，經(jīng)300目細胞篩過濾，流式細胞儀上機檢測并分析。

1.2.3 hUC-MSCs定向內(nèi)皮細胞誘導(dǎo) 取第3代對數(shù)生長期的hUC-MSCs，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105/mL，分別接種于4個T25的培養(yǎng)瓶中，記為A1、A2、A3、A4組，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細胞貼壁后，去除原培養(yǎng)基，換成條件培養(yǎng)基［EGM-2+50 μg/L血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）+10 μg/L成纖維細胞生長因子（bFGF）+體積分數(shù)2%FBS］，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，每2 d換液1次。每天向A1、A2、A3、A4組分別加入濃度為0、1×10-6、10×10-6和100×10-6mol/L apelin-13 20 μL。分別于誘導(dǎo)后1、3、5、7 d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。另設(shè)陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組為第3代hUC-MSCs，陽性對照組細胞為臍靜脈血管內(nèi)皮細胞。

1.2.4 免疫熒光染色 將陰性對照組和誘導(dǎo)（A1、A2、A3、A4）組細胞PBS洗3次后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌 3次×10 min，0.3%曲拉通X-100（TritonX-100）破膜10 min，PBS漂洗3次×10 min，5%BSA處理1 h，加入1∶200綿羊抗人vWF單克隆抗體，4℃孵育過夜，然后用PBS洗3次× 10 min，加入1∶400的抗綿羊熒光抗體，4℃避光孵育2 h，共聚焦顯微鏡下觀察、攝片。

1.2.5 流式細胞鑒定 將陰性對照組和誘導(dǎo)（A1、A2、A3、A4）組（誘導(dǎo)7 d）細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，加入鼠抗人單克隆抗體PE-CD31 20 μL，充分混勻，避光室溫孵育30 min，PBS洗2遍，重新制成細胞懸液0.5 mL，經(jīng)300目細胞篩過濾，流式細胞儀上機檢測并分析。

1.2.6 誘導(dǎo)后內(nèi)皮樣細胞的三維培養(yǎng) 取定向誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細胞，0.25%胰蛋白酶消化，棄上清，5 mL蔗糖溶液重懸，調(diào)整細胞濃度為2×106/mL。將細胞懸液與水凝膠1∶1混合均勻。取250 μL細胞-水凝膠混合液加入三維細胞培養(yǎng)皿中，設(shè)S1、S2、S3、S4組。將細胞培養(yǎng)液（DMEM-F12高糖+體積分數(shù)10%FBS）沿三維細胞培養(yǎng)皿邊緣輕輕注入，覆蓋凝膠上緣即可。置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，每10 min換液1次，共3個循環(huán)，以后每2 d換液1次。每天分別向S1、S2、S3、S4組加入濃度分別為0、1×10-6、10×10-6和100×10-6mol/L apelin-13 20 μL。分別于誘導(dǎo)后1、3、5、7 d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，誘導(dǎo)組與陰性對照組間比較行Dunnett-t檢驗。以Spearman秩相關(guān)分析apelin-13的劑量與CD31表達陽性率的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察hUC-MSCs形態(tài)和生長情況 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)7～8 d后，可見部分細胞從組織塊周圍爬出，呈現(xiàn)多種形態(tài)，10 d后細胞開始迅速增殖，14～15 d左右可鋪滿培養(yǎng)瓶的90%，形成大小不等的細胞集落，見圖1A。傳代后的細胞呈長梭形或分支狀生長，在接種后第4天即大量匯合且呈漩渦狀生長，細胞在增殖傳代過程中形態(tài)無明顯改變，見圖1B。

Fig.1 Human umbilical cord-MSCs observed under inverted microscope（×40）圖1 倒置顯微鏡下觀察hUC-MSCs（×40）

2.2 hUC-MSCs表面標志物表達 流式細胞檢測結(jié)果顯示，P3代hUC-MSCs高表達CD90、CD105、HLA-ABC，而不表達CD45、CD34、CD31、CD309、HLA-DR，見圖2。

2.3 hUC-MSCs定向內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)7 d后細胞形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡下觀察，A1、A2、A3、A4組細胞誘導(dǎo)7 d后細胞密集處呈內(nèi)皮細胞特有的“鋪路石”樣排列。陰性對照組細胞呈長梭形或分支狀，陽性對照組細胞呈典型的“鋪路石”樣外觀，見圖3。

2.4 免疫熒光染色 誘導(dǎo)（A1、A2、A3、A4）組經(jīng)vWF免疫熒光檢測呈陽性，見圖4。證明這類細胞具有內(nèi)皮細胞性質(zhì)。陰性對照組染色呈陰性。

2.5 誘導(dǎo)分化后細胞的表面標志物鑒定 流式細胞儀結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組A1、A2、A3、A4和陰性對照組CD31陽性表達率（%）分別為77.8±1.4、79.4±1.2、80.7±1.2、90.4±1.1和1.8±0.2。A1、A2、A3、A4組CD31的表達強度均明顯高于陰性對照組（F= 23 040.243，n=15，P＜0.01）。表明hUC-MSCs在適宜的條件下，誘導(dǎo)分化出的“鋪路石”樣扁平細胞即為血管內(nèi)皮細胞，且apelin-13濃度與CD31陽性表達率呈正相關(guān)（rs=0.972，P＜0.01），見圖5。

2.6 水凝膠中細胞的形態(tài)及生長存活 倒置相差顯微鏡下可見陰性對照組細胞在水凝膠中均勻分布，呈圓形懸浮生長。陽性對照組和誘導(dǎo)組細胞可見細胞聚集，伸出偽足，形成血管分支樣結(jié)構(gòu)，見圖6。誘導(dǎo)組分支樣結(jié)構(gòu)相互交織，形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖7。

3 討論

Fig.2 Human umbilical cord-MSCs surface markers detected by flow cytometry圖2 hUC-MSCs表面標志物的流式細胞儀檢測結(jié)果

心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為導(dǎo)致人類死亡的首要原因［6］。目前，藥物、介入、外科搭橋手術(shù)均無法使壞死的心肌及血管再生。因此，實現(xiàn)血管再生已成為21世紀細胞生物學(xué)和心血管臨床醫(yī)學(xué)的重大目標。Apelin-13可能是調(diào)控血管再生的關(guān)鍵信號因子。近年來，研究人員在雞胚、斑馬魚、非洲蟾蜍、小鼠等模式動物中發(fā)現(xiàn)，apelin-13蛋白在血管再生過程中發(fā)揮重要作用［7-8］。有研究指出apelin-13是胚胎血管生成和腫瘤血管生成中必不可少的因素［9］。非洲爪蟾基因敲除實驗也進一步證實了apelin相關(guān)信號是體節(jié)間血管新生的重要信號通路。

間充質(zhì)干細胞是血管發(fā)育必不可少的生長因子，可有效地產(chǎn)生VEGF，促進血管生成，穩(wěn)定內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生支持細胞［10］。臍帶來源的間充質(zhì)干細胞來源豐富、增殖分化能力強、安全無毒，適合體外大規(guī)模培養(yǎng)，已成為干細胞研究領(lǐng)域倍受矚目的新型種子細胞。因此本實驗選擇臍帶來源的間充質(zhì)干細胞為種子細胞，利用VEGF聯(lián)合bFGF誘導(dǎo)方案作為血管誘導(dǎo)分化的平臺，將水凝膠作為載體，通過外源性添加apelin-13蛋白，構(gòu)建三維血管網(wǎng)?；诒菊n題組前期工作中已發(fā)現(xiàn)成體干細胞向血管分化過程中有apelin-13表達［11］，在此基礎(chǔ)上通過對apelin-13蛋白的干預(yù)，成功揭示了體外血管再生的可能。

本實驗采用水凝膠作為三維細胞培養(yǎng)材料，構(gòu)建三維血管再生系統(tǒng)模型。水凝膠可以在液態(tài)時包裹細胞，固態(tài)時形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使大量細胞分散黏附于其中，通過物理或化學(xué)交聯(lián)（共價鍵）來維持它的三維結(jié)構(gòu)，形成真正的類細胞外基質(zhì)模型［12］。本研究采用耦合過程開發(fā)了一個三維多尺度模型，包括支架形成過程、外源性生長因子的釋放和血管生成，隨著時間的推移和養(yǎng)分運輸，支架的孔隙率扮演更重要的角色，促進血管形成和血管生成。

目前對于apelin-13促進血管再生的機制尚不明確。相關(guān)研究指出，apelin-13和VEGF的mRNA和蛋白表達水平在新生血管中均明顯增加［13］。本研究結(jié)果顯示，hUC-MSCs在經(jīng)過VEGF誘導(dǎo)后，表達血管內(nèi)皮細胞特異性標志物vWF，且apelin-13濃度與內(nèi)皮分化標記和上調(diào)的標志性因子CD31陽性表達率呈正相關(guān)，提示apelin-13和VEGF具有協(xié)同作用，共同促進血管再生。另外，有研究提出了微環(huán)境的誘導(dǎo)學(xué)說：在微環(huán)境中存在一些細胞外基質(zhì)，它們不僅會影響干細胞的分化過程，同時還會影響分化信號的相關(guān)反應(yīng)，它們的多種分泌物包括基因產(chǎn)物都會參與并調(diào)控干細胞的分化［14］。本實驗在以水凝膠為基礎(chǔ)的三維微環(huán)境中，誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細胞成功分化為血管網(wǎng)，且隨著apelin-13濃度的升高，血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)更加明顯，提示在三維微環(huán)境中，apelin-13蛋白可能加速了誘導(dǎo)分化的過程，但是其具體調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。

（圖3～7見插頁）

［1］Yuan W，Liu W，Li J，et al.Effects of BMSCs interactions with adventitial fibroblasts in transdifferentiationand ultrastructure processes［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（7）:3957-3965.

［2］Lin YC，Ko TL，Shih YH，et al.Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic stroke［J］.Stroke，2011，42 （7）:2045-2053.

［3］Mok PL，Leong CF，Cheong SK.Cellular mechanisms of emerging applications of mesenchymal stem cells［J］.Malays J Pathol，2013，35（1）: 17-32.

［4］Wang L，Xu XX，Zhang NK，et al.Transfection of lentivirus recombined with marker gene into human umbilical cord Wharton’s jellyderived mesenchymal stem cells［J］.Tianjin Med J，2013，41（10）:985-988.［王力，徐小紅，張寧坤，等.攜帶標記基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的實驗研究［J］.天津醫(yī)藥，2013，41（10）:985-988］.doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2013.10.012.

［5］Antushevich H，Krawczynska A，Kapica M，et al.Effect of apelin on mitosis，apoptosis and DNA repair enzyme OGG 1/2 expression in intestinal cell lines IEC-6 and Caco-2［J］.Folia Histochem Cytobiol，2014，52（1）:51-59.

［6］Lloyd-Jones D，Adams RJ，Brown TM，et al.Executive summary: heart disease and stroke statistics--2010 update:a report from the American Heart Association［J］.Circulation，2010，121（7）:948-954.

［7］Xu XX，Wang L，Zhang NK，et al.Influence of apelin-13 on 5-azacytidine inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells to cardiomyocytes［J］.Med J Chin PLA，2013，38（10）:796-800.［徐小紅，王力，張寧坤，等.Apelin-13對5-Aza誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向心肌細胞分化的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（10）:796-800］.doi:10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.003.

［8］Cho J，Zhai P，Maejima Y，et al.Myocardial injection with GSK-3β-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuates cardiac dysfunction after myocardial infarction［J］.Circ Res，2011，108（4）:478-489.

［9］Ieda M，F(xiàn)u JD，Delgado-Olguin P，et al.Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors［J］.Cell，2010，142（3）:375-386.

［10］Simonavicius N，Ashenden M，van Weverwijk A，et al.Pericytes promote selective vessel regression to regulate vascular patterning［J］.Blood，2012，120（7）:1516-1527.

［11］Gao LR，Zhang NK，Bai J，et al.The apelin-APJ pathway exists in cardiomyogenic cells derived from mesenchymal stem cells in vitro and in vivo［J］.Cell Transplant，2010，19（8）:949-958.

［12］Roura S，F(xiàn)arré J，Hove-Madsen L，et al.Exposure to cardiomyogenic stimuli fails to transdifferentiate human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells［J］.Basic Res Cardiol，2010，105（3）: 419-430.

［13］Lu Q，F(xiàn)eng J，Jiang YR.The role of apelin in the retina of diabetic rats［J］.PLoS One，2013，8（7）:e69703.

［14］Doan CC，Le TL，Hoang NS，et al.Differentiation of umbilical cord lining membrane-derived mesenchymal stem cells into endotheliallike cells［J］.Iran Biomed J，2014，18（2）:67-75.

（2015-02-13收稿 2015-04-13修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Apelin-13 promote mesenchymal stem cells isolated from Wharton’s jelly to differentiate into vascular networks

GAO Yanlin1，CHEN Houliang2，ZHANG Ningkun2，GAO Lianru2，ZHU Zhiming1△
1 Clinical College of Navy Medicine，Anhui Medical University，Anhui 230000，China；2 Department of Cardiology，Navy General Hospital
△Corresponding Author E-mail：zhuzhiming6542@sina.com

Objective To explore the role of apelin-13 in regulating stem cell differentiation into vascular net.Methods Mesenchymal stem cells were isolated from human umbilical Wharton’s jelly using tissue adherence method.Their immunophenotypes were detected by flow cytometry.Passage 3 of WJ-MSCs（Wharton’s jelly-mesenchymal stem cells）were inoculated in 4 flasks，denoted as A1，A2，A3，A4 group.Twenty μL of apelin-13 at concentrations of 0，1×10-6，10× 10-6and 100×10-6mol/L were added to A1，A2，A3 and A4 respectively each day.After being induced for 7 days，cell morphology and viability were observed under inverted microscope.Von Willebrand factor（vWF）was examined by immunofluorescence and CD31 was identified by flow cytometry.Upon incubating with three dimensional culture medium of hydrogel，those cultured A1，A2，A3 and A4 were renumbered as S1，S2，S3，S4.Again，twenty μL of apelin-13 at concentrations of 0，1×10-6，10×10-6and 100×10-6mol/L were used to treat S1，S2，S3 and S4 respectively.After 7 days，cell morphology，viability and vas-like networks were observed with inverted microscope.Results Our study showed that WJ-MSCs can be induced by apelin 13 to differentiate into endothelial cells lineage indicated by positive of vWF staining.Moreover，CD31 expression increases significantly upon apelin-13 addition in a dosage dependent manner.The endothelial cells line formed vas like networks when cultured with three-dimensional medium containing hydrogel.Conclusion This study demonstrated that apelin-13 could promote human umbilical cord-MSCs to differentiate into endothelium lineage then to form vascular networks.

mesenchymal stem cells；apelin-13；angiogenesis；3-dimensional culture，umbilical cord

R329.2

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.005

國家自然科學(xué)基金資助項目（81170094）

1安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院（郵編230000）；2海軍總醫(yī)院心臟中心

高彥琳（1989），女，碩士在讀，主要從事干細胞治療缺血性心肌病方面的研究

△E-mail：zhuzhiming6542@sina.com