李曉 童曉云 倪凱 楊建紅 侯肖霖 胡孝剛

摘要：目的探討強心膠囊對心力衰竭大鼠心臟血流動力學及絲裂原活化蛋白激酶（ MAPK）信號通路的影響。方法采用鹽酸阿霉素腹腔注射法制作心衰大鼠模型，造模成功后的50只大鼠隨機分為模型對照組、卡托普利組、強心膠囊低、中、高劑量組 另設(shè)正常對照組10只。分別給予生理鹽水20mL/kg、卡托普利組100mg/kg、強心膠囊0.2g/kg、強心膠囊0.4g/kg、強心膠囊0.8 g/kg、生理鹽水20mL/kg灌胃給藥4周，4周后觀察心衰大鼠血流動力學改變，Westem印跡法觀察心衰大鼠心肌ERK、P38、JNK的表達情況。結(jié)果強心膠囊低、中、高劑量組均可改善心衰大鼠的血液動力學（P<0.05），且對心衰大鼠心率無明顯影響，其中強心膠囊高劑量組效果與卡托普利組相仿；與模型對照組比較，強心膠囊中、高劑量組ERK、P38、JNK的蛋白表達水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論中、高劑量強心膠囊可改善心衰大鼠血流動力學指標，可能與其通過下調(diào)MAPK通路ERK、P38、JNK蛋白的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：強心膠囊；心力衰竭；MAPK通路

中圖分類號：R285

文獻標志碼：A

文章編號：1007 - 2349（ 2015） 01 - 0062 - 03慢性心力衰竭（ Chronic Heart Failure，CHF）的發(fā)生與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活有關(guān)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要是通過信號傳導途徑，長期、慢性激活促進心肌重塑，最終導致CHF的發(fā)生。CHF的發(fā)生、發(fā)展起重要作用的是細胞凋亡，絲裂原活化蛋白激酶（ Mitogen activated protein kinase.MAPK）是調(diào)控細胞增長與凋亡過程的重要信號轉(zhuǎn)導途徑，主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ ERK）、P38蛋白激酶、c-jun N末端激酶（JNK）等亞型[1]。強心膠囊由生黃芪、制附子、生曬參、澤瀉、血竭等13味中藥組成，其功效為益氣活血，溫陽利水，臨床用于治療心力衰竭已10余年，取得了較好的臨床療效。本研究以強心膠囊干預心力衰竭大鼠，觀察心衰大鼠血流動力學改變，用Western印跡法進行MAPK信號通路相關(guān)ERK、P38、JNK蛋白表達的檢測，進一步探討強心膠囊治療CHF可能的作用靶點，現(xiàn)報道如下。1 材料與儀器1.1 實驗動物成年清潔級雄性SD大鼠100只，體重180 -220g，購白昆明醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（昆）2011 - 0004，常規(guī)條件飼養(yǎng)，保持室溫23 - 25℃，濕度30% -70%。1.2實驗藥物與試劑 強心膠囊：生黃芪、制附子、生曬參、桂枝、血竭等13味中藥組成，0. 4g/粒，由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制作，批號20130429；注射用鹽酸阿霉素，lOmg/支，浙汀海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號130703；卡托普利：25 mg/片，北京亞寶生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號12080031；BS368（ bioworld）； ab31828（ abcam）， BS1544（ bioworld）； Ab75744（ ab-cam）；30%丙烯酰胺；ddH20；SDS（ Amresco）；TEMED（ Sigma）等。1.3實驗主要儀器與材料 電子天平為Sartorius公司（德國）產(chǎn)品，微量加樣器為Cilson公司（法國）產(chǎn)品，微量加樣吸頭為北京鼎同牛物有限公司產(chǎn)品，電熱恒溫水浴槽為上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠產(chǎn)品，- 80℃低溫冰箱為SANYO（日本）產(chǎn)品，制冰機為AF10 SCOTSMAN（美國）產(chǎn)品，PVDF膜（孔徑為0. 22μm）為Millipore公司產(chǎn)品，醫(yī)用X射線膠片為柯達公司產(chǎn)品，通用顯影粉、酸性定影粉為天津亨達公司感光材料廠產(chǎn)品，高速離心機為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品，轉(zhuǎn)移脫色搖床為海門其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品，旋渦混勻器為海門麒麟醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品，電泳儀為北京百晶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，低溫離心機為德國Sigma公司產(chǎn)品，凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽為美國BIO - Rad公司產(chǎn)品，美國UVP凝膠成像系統(tǒng)，為thermo公司產(chǎn)品，型號：CA91786 USA UVPGDS - 8000 System。半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)為ATTO公司產(chǎn)品，型號：WSF - 4040。2實驗方法2.1 動物模型復制、分組、給藥100只成年SD雄性大鼠，隨機抽取10只為正常對照組，余90只采用腹腔注射鹽酸阿霉素法復制心衰大鼠模型21，按第1次和第2次1. 0mg/kg.d劑最；第3次和第4次2. 0mg/kg.d劑量；第5次和第6次1.0mg/kg.（1劑量；第7次和第8次2.Omg/kg.d劑量；累積劑量12mg/kg，隔天注射，共計15d，觀察大鼠表征及行為改變。l5大后行心臟彩超檢查，以左室射血分數(shù)（ LVEF）值低于45%作為心衰模型成功的標志，同時大鼠出現(xiàn)體重減輕、精神萎靡、毛色無光澤，列入觀察對象。篩選存活且造模成功的50只夫鼠按隨機分為5個組：M組為模型對照組（生理鹽水20mL/kg）；K組為卡托普利組（100mg/kg溶于生理鹽水）；D組為強心膠囊低劑量組（0. 2g/kg，相當于人的臨床劑量的2.5倍）；Z組為強心膠囊中劑量組（0. 4g/kg，相當于人的臨床劑量5倍）；G組為強心膠囊高劑量組（0.8 g/kg，相當于人的臨床劑量的10倍）。Y組為正常對照組（生理鹽水20mL/kg），連續(xù)灌胃給藥4周，觀察整個實驗過程中大鼠一般情況。2.2 血流動力學指標測定各組灌喂不同藥物4周后，于末次給藥后6h，以25%烏拉坦按SmL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥固定分離右側(cè)頸總動脈，由頸總動脈插管至左心室，連接八導生理記錄儀，記錄動脈收縮壓（ SBP）、動脈舒張壓（ DBP）、心率（HR）、平均動脈壓（MAP）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（ LVEDP）、左室內(nèi)壓最大收縮率（+dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大舒張壓（- dp/dtmax）。2.3

Westem印跡法檢測ERKI/2、p38和JNK蛋白表達2.3.1 心肌采集，蛋白提取各組于灌喂不同藥物4周后各取3只大鼠，腹腔注射麻醉處死大鼠，仰臥固定四肢，取出心臟，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，勻漿，心肌組織蛋白提取，- 80℃保存?zhèn)溆谩?.3.2制備SDS - PAGE凝膠，組裝電泳槽將灌膠玻璃板洗凈，晾干固定，配制10%分離膠8 mL快速灌入凝膠玻璃槽中；立即用去離子水覆蓋膠面，室溫放置約40 min至分離膠凝固；配制5%濃縮膠4 mL；倒掉去離子水覆蓋液，并用吸水紙吸掉殘留的液體；將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%濃縮膠液，插入樣品梳，室溫凝膠約40 min。輕輕拔去梳子，將玻璃夾板“凹”面貼緊電泳槽，固定在電泳槽上。2.3.3樣品變性及電泳、凝膠轉(zhuǎn)膜及曝光、洗片、掃描由一80℃冰箱取出提取的組織總蛋白樣品，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合，95℃變性10 min，將電壓調(diào)至80V，使樣品通過濃縮膠與分離膠（電壓約8v/cm）。電泳使染料至分離膠適當位置，結(jié)束電泳。凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后分別用非標記·抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育，洗膜，曝光洗片.，采用美國UVP分析儀器，對膠片進行掃描，然后括住每·個條帶，系統(tǒng)自動生成灰度值，即為結(jié)果。2.4統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差表示，多樣本均數(shù)比較用one - way ANOVA法，數(shù)據(jù)先進行方差齊性的Levene檢驗，方差齊時用組間比較的LSD法，符合正態(tài)分布但方差不齊時用Tamhane's T2檢驗。3實驗結(jié)果3.1 各組大鼠血流動力學情況各組大鼠血流動力學情況見表1。由表l可見，模型對照組血壓（ SBP、DBP、MAP）與正常對照組及各治療組比較均有顯著性差異（P<0.05），強心膠囊低、中、高劑量組Im壓與劑量呈正相關(guān)，強心膠囊高劑量組與卡托普利組之間差異無顯著統(tǒng)計學意義，提示強心膠囊高劑量組與卡托普利組效果相仿；各組間心率差異無顯著統(tǒng)計學意義；與空白對照組的左室收縮壓、左室舒張末壓、左窀內(nèi)壓最大收縮率、左室內(nèi)壓最大舒張率相比，模型對照組及各治療組均存在顯著性差異；強心膠囊低、中、高劑量組左室舒張末壓與劑量呈負相關(guān)，左室收縮壓、左室內(nèi)壓最大收縮率及左室內(nèi)壓最大舒張率與劑量呈正相關(guān)；與卡托普利組相比，強心膠囊高劑量組左室收縮壓、左室舒張末壓、左室內(nèi)壓最大收縮率及左室內(nèi)壓最大舒張率之間差異無顯著統(tǒng)計學意義。3.2 各組大鼠心肌ERK、P38、JNK蛋白表達水平 Westem印跡法檢測結(jié)果顯示，與模型對照組比較，強心膠囊中、高劑量組的ERK、P38、JNK的蛋白表達水平均不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義，見表2。4討論

慢性心力衰竭屬祖國醫(yī)學中“心悸”、“胸痹”、“喘證”、“怔忡”、“水腫”、“痰飲”等范疇。祖國醫(yī)學認為，心衰為本虛標實之證，本虛以氣虛為基礎(chǔ)，甚則氣損及陽，血脈瘀滯為中心病理環(huán)節(jié)，瘀血、痰濁、水飲是其標實之候。強心膠囊即是以為治則研制的純中藥制劑，強心膠囊由生黃芪、制附子、生曬參、桂枝、血竭、葶藶子、車前子等13昧中藥組成，治以益氣溫陽、活血利水，方中黃芪、附片為主藥，以益氣溫陽；生曬參、桂枝為臣藥，以助主藥益心氣，通心陽，推動血液運行；血竭等活血化瘀；葶藶子、車前子化痰利水消腫，諸藥合用，祛邪而不傷正。據(jù)現(xiàn)代藥理研究證實，上述藥物有增強心肌收縮力、利尿、擴血管、降低血黏度等作用，臨床治療CHF療效確切。

MAPK是脊椎動物體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，屬于細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，是細胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號通路，在缺血、缺氧、牽張、激素、生長因子和細胞因子等各種細胞外刺激.可誘導基因表達、細胞增殖等核反應(yīng)，因此，有細胞質(zhì)和細胞核聯(lián)系的樞紐之稱。它可將胞外刺激信號傳遞給胞核，與細胞連接以及內(nèi)皮通透性等有密切關(guān)系。近年來，MAPK通路研究表明[3-4]，MAPK信號傳導通路在心肌細胞肥大的啟動以及心肌細胞肥大從代償狀態(tài)進入心衰的轉(zhuǎn)換中起重要作用，活化的MAPK轉(zhuǎn)位人核后引起轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，提高應(yīng)激蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平，合成相關(guān)蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮心肌保護作用。目前，已在哺乳動物細胞克隆和鑒定出4條MAPK通路，即細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular sig-nal regulated protein kinase.ERKl/2）通路、c- Jun氨基末端激酶（c- Jun amino - terminal kinase，JNK/SAPK）通路、p38通路和ERK5通路[5]。這些激酶的信號通路具有高度保守性，即都由3個關(guān)鍵酶經(jīng)過級聯(lián)信號將胞外刺激傳遞到胞核，通過磷酸化因子調(diào)節(jié)細胞功能[6-7]。在MAPK通路的復雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，ERK、JNK、p38MAPK是具有代表性的三個亞類。在應(yīng)用藥物干預過程中，通過檢測上述通路蛋白的相關(guān)表達，可揭示干預藥物的部分作用機理。

本研究結(jié)果顯示，強心膠囊低、中、高劑量組均可改善心衰大鼠的血液動力學，且對心衰大鼠心率無明顯影響，其中強心膠囊高劑量組效果與卡托普利組相仿。強心膠囊中、高劑量組ERK、P38、JNK的蛋白表達水平較模型組均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義，但低劑量組的差異無統(tǒng)計學意義。低劑量組出現(xiàn)上述情況可能與中藥的多成分性有關(guān)，影響了藥物與受體的親和力和內(nèi)在活性，使蛋白的表達不明顯。綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)強心膠囊可改善心衰大鼠的血液動力學情況，并通過對心衰大鼠MAPK信號通路相關(guān)ERK、P38、JNK蛋白表達的檢測，表明強心膠囊可能是通過ERK通路進行應(yīng)激介導，調(diào)節(jié)心肌肥大相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促使相關(guān)心肌細胞凋亡，清除受損的心肌細胞；可能通過JNK通路抑制血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素以及兒茶酚胺的激活；并可能通過p38MAPK促進白細胞的聚集和活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性及細胞因子的合成，從而控制炎癥反應(yīng)、改善心衰。通過本研究，初步揭示了強心膠囊改善心衰大鼠血液動力學的部分機理，為臨床治療CHF提供了一定的實驗依據(jù)。參考文獻：[1] Downward J The ins and outs of signaling[J]. Nature， 2001，411（ 6839）：759.[2]李梅秀，田國忠，歐葉濤，等大鼠阿霉素慢性心衰模型的制備與心衰指標的判定[J].解剖學研究，2005，27（3）：176-178.[3] Ravingerova T，Barancik M，Strniskova M. Mitogen-activated protein kinases：a new therapeutic target in cardiac pathology. Mol Cell Bio-Chem ，2003 ，247（1 -2）：127 - 138.[4] Sugden P H.Signalling pathways in cardiac myocyte hypertrophy. AnnMed，2001 ，33（9）：611 - 622.[5] Wang X，Tournier C.Regulation of cellular functions by the ERK5 siglalling pathey.Cell Signal，2006； 18（6）：753 - 760.[6]姜勇，RJ Ulevitch.LPS介導細胞激活的信號轉(zhuǎn)導：從CD14到p38MAPK通路的研究，生理科學進展，1999，30（1）：29 -34.[7]Lee M，Choi L，Park K. Activation of stress signaling molecules in bat brain during aroused from hibernation. J - Neurochem，2002，82（4）：867 - 873（收稿日期：2014 - 11 - 10）