張艷俠 徐超 張立華

摘要：為探討pH示差法測(cè)定茄子皮中花青苷的含量，用酸性乙醇溶液從茄子皮中提取花青苷，確定提取液的最大吸收波長(zhǎng)、pH值的變化及平衡時(shí)間，還做了精密度試驗(yàn)、回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，茄子皮提取液的最大吸收波長(zhǎng)為530 nm，pH值選定為1.0、4.5，反應(yīng)平衡時(shí)間為90 min，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%（n=6），加標(biāo)回收率為9642%。該方法能有效消除溶液中雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，可用于茄子皮中花青苷的定量分析。

關(guān)鍵詞：茄子皮；花青苷；pH示差法；定量分析

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0338-02

花青素是具有2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)的衍生物，是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素。自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見(jiàn)，其A環(huán)3-、5-、7-碳位上的羥基以糖苷鍵與一些單糖結(jié)合形成花青苷，因結(jié)合糖基的種類(lèi)、數(shù)量、結(jié)合位置不同，花青苷的種類(lèi)有所不同[1]?；ㄇ嘬站哂锌寡趸⑾杂苫?、降低血清膽固醇、抗變異、抗腫瘤、促進(jìn)視網(wǎng)膜上視紅素再合成等生理功能，因而花青苷被作為功能性食品添加劑，具有果香味、水溶性好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已被消費(fèi)者普遍接受[2]。茄子（Solanum melongena L.）果皮多紫紅色，含有豐富的花青苷，且穩(wěn)定性好。我國(guó)茄子種植面積大，其皮為副產(chǎn)物，因此茄子皮色素是一種極具開(kāi)發(fā)前景的天然食用色素[3]，但目前對(duì)于其含量的測(cè)定缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

花青苷的定量分析方法通常有：?jiǎn)我籶H法、差減法、高效液相色譜法、pH示差法。其中單一pH法測(cè)定花青苷時(shí)準(zhǔn)確度相對(duì)較低，當(dāng)僅以含量作為指標(biāo)的對(duì)比依據(jù)時(shí)，可選用單一pH法，操作簡(jiǎn)便；差減法在測(cè)定花青苷含量的過(guò)程中，由于干擾組分的吸光度受提取試劑的影響，從而使得理論測(cè)定總花青苷的濃度準(zhǔn)確度降低[4]；高效液相色譜技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用于菠蘿、柑橘、桃、杏等果實(shí)中的糖、酸組分和含量的測(cè)定，并具備高效、高靈敏度、分析速度快、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，且方法精密度高、重復(fù)性好，但在測(cè)定花青苷單體含量時(shí)，要對(duì)樣品花青苷進(jìn)行分離純化，并需要花青苷單體標(biāo)準(zhǔn)品，而花青苷標(biāo)準(zhǔn)品的不穩(wěn)定，或是不明確樣品中的花青苷單體組成，使該方法的使用受到限制[5]。有人研究pH示差法測(cè)定葡萄[6]、桑椹[7]中花青苷含量，結(jié)果表明該法的準(zhǔn)確度較高、重現(xiàn)性好，而且操作方法簡(jiǎn)便、設(shè)備儀器較低廉、便于推廣。本試驗(yàn)進(jìn)行pH示差法測(cè)定茄子皮中花青苷含量的方法學(xué)研究，以期為茄子皮乃至其他植物材料中花青苷的定量分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為在棗莊當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買(mǎi)的新鮮成熟的茄子，品種為臺(tái)灣紅茄，用打皮刀削取茄子皮備用。

試驗(yàn)試劑：無(wú)水乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；濃鹽酸、氫氧化鉀（山東省萊陽(yáng)市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠(chǎng)）；乙酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)）等。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器有：UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼科儀器有限公司）、電子分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）、pHS-2F型酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、KS-300EI型超聲波清洗機(jī)（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司）。

1.3 技術(shù)路線(xiàn)

準(zhǔn)備植物材料→花青苷的提取→最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定→pH值的確定→反應(yīng)平衡時(shí)間的確定→精密度試驗(yàn)→回收試驗(yàn)。

1.4 茄子皮中花青苷的浸提

準(zhǔn)確稱(chēng)量5 g茄子皮，按照1 g ∶10 mL的料液比加入酸性乙醇溶液，在50 ℃下浸提30 min；將過(guò)濾的濾液重復(fù)浸提3～4次；合并濾液并定容至250 mL。

1.5 測(cè)定花青苷的最大吸收波長(zhǎng)

用酸性乙醇溶液將茄子皮浸提液稀釋至適當(dāng)濃度，在400～600 nm可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描，繪制吸收光譜曲線(xiàn)，并找出峰值。

1.6 pH值的選定

以溶液pH值為變量構(gòu)建梯度試驗(yàn)，在已測(cè)得的最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)量茄子皮浸提液的吸光度。繪制pH值-吸光度（D）曲線(xiàn)，選擇最適pH值，要求在選定的2個(gè)pH值左右變動(dòng)時(shí)吸光度變化不大。

1.7 平衡時(shí)間

在選定的2個(gè)最適pH值條件下，每隔20 min測(cè)量1次樣品的吸光度，觀(guān)察溶液吸光度隨時(shí)間的變化，確定溶液的反應(yīng)平衡時(shí)間。

1.8 精密度試驗(yàn)

將浸提液靜置至反應(yīng)平衡后，在已測(cè)得的最適pH值及最大吸收波長(zhǎng)下，測(cè)量花青苷的吸光度，平行測(cè)定6次。按照Fuleki等的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算茄子皮中的花青苷含量[8]：

X=ΔDVFM×1 000/（εm）。

式中：X為茄子皮中的花青苷含量，mg/g；ΔD為pH值為1.0、4.5時(shí)吸光度的差值；V為稀釋體積，L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量；ε為矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.9 回收試驗(yàn)

采用加入回收法，在試樣中加入已知量的被測(cè)組分與等量的另1份相同的平行試樣進(jìn)行分析，求得加入的被測(cè)組分的回收率，根據(jù)回收率檢查系統(tǒng)誤差的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)

取一定量的茄子皮浸提液，用酸性乙醇溶液稀釋?zhuān)?00～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行可見(jiàn)光掃描，并繪制吸收光譜圖曲線(xiàn)。由圖1可知，在400～600 nm可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)，浸提液中花青苷的吸光度變化表現(xiàn)為先增加后減小，即只存在唯一的峰值，可以看出，茄子皮中花青苷的最大吸收波長(zhǎng)為530 nm。

2.2 pH值確定

為保證pH示差法有較高的的準(zhǔn)確性和靈敏度，在選擇pH值時(shí)應(yīng)考慮以下3點(diǎn)：（1）所選擇的2個(gè)pH值處所測(cè)得的花青苷吸光度差異應(yīng)當(dāng)是顯著的；（2）單一pH值的變動(dòng)，對(duì)花青苷的吸光度影響應(yīng)是極小的；（3）花青苷在所處的2個(gè)最適pH值條件下，其結(jié)構(gòu)應(yīng)是相當(dāng)穩(wěn)定的。由于花青苷只在酸性介質(zhì)中可以保持穩(wěn)定，因而試驗(yàn)中只測(cè)定酸性介質(zhì)中不同pH值條件下花青苷浸提液最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變化，并以pH值為橫坐標(biāo)、吸光度D530 nm為縱坐標(biāo)作圖，詳見(jiàn)圖2。從圖2可以得知，在pH值為0.8～ 1.5、4.0～ 5.0這2個(gè)區(qū)域內(nèi)，pH值的輕微變動(dòng)對(duì)吸光度的變化影響較小，并且在這2個(gè)pH值范圍內(nèi)，花青苷在酸性介質(zhì)中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。綜上所述，選擇的2個(gè)pH值分別為10、4.5。

2.3 反應(yīng)平衡時(shí)間

花青苷在溶液介質(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一pH值下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)pH值改變時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢(shì)是pH值降低時(shí)，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子移動(dòng)；pH值升高時(shí)，平衡向藍(lán)色醌式移動(dòng)，并隨時(shí)間的變化達(dá)到一個(gè)新的平衡。因此提取液用緩沖液稀釋后，必須靜置一段時(shí)間，等動(dòng)態(tài)平衡處于穩(wěn)定后，才能測(cè)定吸光度。試驗(yàn)中量取等量的浸提液，分別調(diào)其pH值至1.0、45，每隔20 min測(cè)量其吸光度，觀(guān)察溶液吸光度隨時(shí)間的變化，確定溶液平衡的時(shí)間，茄子皮花青苷在不同pH值溶液中的吸光度隨時(shí)間的變化見(jiàn)表1。

由表1可知，在不同的緩沖溶液中隨時(shí)間的變化，花青苷的吸光度不同。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，在pH值為1.0的緩沖溶液中花青苷的吸光度基本穩(wěn)定；在pH值為4.5的緩沖溶液中花青苷的吸光度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，90 min時(shí)處于穩(wěn)定狀態(tài)。因此，選擇花青苷在緩沖液中的平衡時(shí)間為90 min。

2.4 精密度試驗(yàn)

按照“1.4”節(jié)的提取方法制得茄子皮花青苷浸提液 500 mL，從500 mL提取液中準(zhǔn)確量取2份各25 mL的溶液，分別調(diào)節(jié)pH值至1.0、4.5，在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度D530 nm，平行測(cè)定6次。按照相關(guān)公式計(jì)算樣品中花青苷含量，結(jié)果（表2）可知，茄子皮中花青苷平均含量為0120 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%。

2.5 回收試驗(yàn)

從上述茄子皮花青苷浸提液中準(zhǔn)確量取2份100 mL溶液，分別標(biāo)記為1、2，在50 ℃條件下真空干燥。將材料1溶解于100 mL 1.2 mol/L HCl-70%乙醇溶液中，用本研究的方法測(cè)定酸性乙醇中花青苷的含量，即為加標(biāo)量。將材料2再溶解于100 mL浸提液中， 采用相同方法測(cè)定浸提液中加標(biāo)后花青苷的含量。將材料2試驗(yàn)所測(cè)得的含量減去浸提液中原有花青苷含量，即為加標(biāo)樣的實(shí)際測(cè)得量。由測(cè)定結(jié)果、回收率（表3），可以看出，平均回收率為96.42%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，茄子皮中花青苷的最大吸收波長(zhǎng)為530 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的花青苷最大吸收波長(zhǎng)在520～540 nm之間的數(shù)據(jù)相符。而反應(yīng)平衡時(shí)間由于受到溫度、濕度、提取時(shí)間等因素的影響，會(huì)有較大的差別；根據(jù)相關(guān)研究可以看出，反應(yīng)平衡時(shí)間選擇在90～110 min對(duì)試驗(yàn)不會(huì)有影響。通過(guò)精密度試驗(yàn)結(jié)果得出，茄子皮中花青苷的含量為 0.120 mg/g，而根據(jù)加入回收法測(cè)得的平均回收率為9642%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%，可知溶液中其他因素對(duì)花青苷含量測(cè)定的影響極小，可以忽略不計(jì)?？傊?，采用pH示差法對(duì)茄子皮中花青苷的含量進(jìn)行定量分析，能有效地消除溶液中其他有機(jī)雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，可信度較高，為今后的茄子皮及其他植物果實(shí)中花青苷定量分析提供了一定的理論依據(jù)。

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