孫瑞萍　晁哲　鄭心力　王峰　黃麗麗　劉圈偉　魏立民

摘要：將36頭質(zhì)量為（61.70±1.00） kg的海南豬隨機(jī)分為2個處理組，分別飼喂高、低能量水平的2種日糧，以研究不同能量水平對IGFBP6基因表達(dá)量及生產(chǎn)性能的影響。相比之下，高能量水平飼糧可顯著提高海南豬平均日增質(zhì)量（P<0.05），并顯著降低料肉比（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果表明，低能量水平飼糧可促進(jìn)IGFBP6基因表達(dá)量。海南豬IGFBP6基因表達(dá)量與平均日增質(zhì)量、平均日采食量均呈不顯著正相關(guān)（P>0.05）；與料肉比呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。飼糧能量水平可影響海南豬的生產(chǎn)性能，但對海南豬IGFBP6基因表達(dá)量的影響不顯著。

關(guān)鍵詞：海南豬；能量水平；IGFBP6基因；基因表達(dá)

中圖分類號： S828.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0035-03

豬生長性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，而營養(yǎng)是除遺傳因素外影響生長的另一個重要因素，它雖然無法改變動物的遺傳性狀，但可通過營養(yǎng)學(xué)途徑，調(diào)控豬生長等數(shù)量性狀基因的表達(dá)，從而在表型上改善胴體品質(zhì)和肉質(zhì)。IGFBPs在GH/IGFs生長軸的調(diào)節(jié)中起著重要作用，這些結(jié)合蛋白的作用受營養(yǎng)、生理條件、其他激素等諸多因素的影響。IGFBP6基因作為IGFs超家族中的一員，在成年動物體內(nèi)廣泛表達(dá)，因其與 IGF-2 結(jié)合的特異性而受到研究者們關(guān)注。近幾年研究表明，IGF2基因在胎兒生長發(fā)育、肌肉生長等方面具有重要調(diào)控作用，與豬的生長速度、背膘厚等產(chǎn)肉性狀相關(guān)[1-4]，是影響動物生長發(fā)育的主要候選基因。在IGF依賴型作用途徑中，IGFBP6通過與IGF-2的結(jié)合對動物的生長發(fā)育調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要影響。海南豬是我國地方豬的一個品系，適應(yīng)性和抗逆性極強(qiáng)，具有肉質(zhì)細(xì)嫩、胴體瘦肉率高、肌纖維特細(xì)、肌間脂肪多等優(yōu)點(diǎn)。迄今，關(guān)于IGFBP6對動物生長發(fā)育影響的研究尚較少，且主要集中于不同品種豬IGFBP6基因mRNA在不同組織間表達(dá)量的研究[5-7]，而關(guān)于不同能量水平對豬 IGFBP6 基因mRNA表達(dá)量的影響，以及IGFBP6基因mRNA表達(dá)量與生產(chǎn)性能相關(guān)性的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術(shù)并結(jié)合生長性狀，探討不同能量水平對海南豬IGFBP6基因表達(dá)量的影響，以及IGFBP6基因表達(dá)量與生長的相關(guān)性，以期從分子水平解釋營養(yǎng)對生長產(chǎn)生影響的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

采用單因子試驗設(shè)計，將36頭質(zhì)量為（61.70±1.00） kg的海南豬隨機(jī)分為2個處理組，分別飼喂高、低能量水平的日糧，每個處理組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬。高能量水平日糧參照NRC（1998）《豬營養(yǎng)需要》配制，確定消化能（DE）為14.21 MJ/kg；低能量水平日糧參照NY/T 65—2004《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制，確定DE為12.95 MJ/kg，蛋白質(zhì)含量均為1300%（表1）。

1.2 飼養(yǎng)管理

按照海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬場飼養(yǎng)管理辦法進(jìn)行飼養(yǎng)管理，在7 d預(yù)飼期后，對2個處理組分別飼喂高、低營養(yǎng)水平的飼料。試驗期用濕拌料，每日喂2次，自由飲水，保持圈舍清潔并定期消毒，正式試驗期為40 d。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 生長性能指標(biāo) 分別于試驗開始、結(jié)束時空腹稱質(zhì)量，以圈為單位計算日采食量、日增質(zhì)量、料肉比。

1.3.2 樣本采集 試驗結(jié)束時，選取12頭質(zhì)量接近于平均質(zhì)量的海南豬進(jìn)行屠宰取樣（每重復(fù)選2頭，每處理組選6頭），肉樣采集位置為個體的最后肋骨、最后腰椎間的單側(cè)背最長肌，采集后立即置于液氮中速凍并于-70 ℃保存，用于提取肌肉組織總RNA。

1.3.3 IGFBP6基因?qū)崟r定量表達(dá)量的測定 取最后肋背最長肌樣本約30 mg，加入液氮并研磨成粉，轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf管中，采用RNA Simple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，按說明書進(jìn)行操作。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA的完整性，并通過D260 nm/D280 nm檢測樣本純度。采用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（天根公司產(chǎn)品）對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT），配制反應(yīng)體系、設(shè)置反應(yīng)條件、合成cDNA均按說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Primer primer 5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工有限公司進(jìn)行合成（表2）。

使用實(shí)時熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為20μL：模板

1.4 統(tǒng)計與分析

采用2-ΔΔCT計算方法分析目的基因的相對表達(dá)量。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對海南豬組織IGFBP6基因相對表達(dá)量進(jìn)行t檢驗及相關(guān)性分析，試驗結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用LSD法進(jìn)行平均數(shù)之間的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧能量水平對海南豬生長性能的影響

由表3可知，日糧能量水平對海南豬平均日增質(zhì)量、料肉比的影響均達(dá)顯著水平（P<0.05），而對末質(zhì)量、平均采食量的影響則不顯著（P>0.05）。初始質(zhì)量差異不顯著的海南豬經(jīng)40 d的飼養(yǎng)，其試驗期末質(zhì)量雖未達(dá)顯著水平，但各能量水平組的平均日增質(zhì)量均達(dá)到顯著水平?？梢?，提高生長后期日糧的能量水平，可顯著提高海南豬的平均日增質(zhì)量，降低料肉比。

2.2 能量水平對IGFBP6基因表達(dá)量的影響

由圖1可知，在低能量水平條件下，IGFBP6基因表達(dá)量為1.09，高能量水平條件下為0.82，兩者差異不顯著（P>0.05）。

2.3 IGFBP6基因表達(dá)量與生長性能的相關(guān)性分析

由表4可知，IGFBP6基因表達(dá)量與料肉比呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與平均日增質(zhì)量、平均日采食量均呈不顯著正相關(guān)（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

能量是動物生長發(fā)育、繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，能量過量或缺乏均可引起豬生長速度的變化或質(zhì)量的增減。馬書林在研究不同能量水平對奶牛生產(chǎn)性能、繁殖性能的影響時指出，將哺乳奶牛日糧的能量水平提高10%～20%，對其產(chǎn)奶量的影響雖與對照組差異不顯著（P>0.05），但添加能量可減緩奶牛質(zhì)量的下降[8]。賈金鳳研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高豬育肥期日糧的能量水平，可提升豬的日增質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益[9]。劉秋研究發(fā)現(xiàn)，不同能量水平對豪豬全期平均日采食量、日增質(zhì)量、料肉比的影響均達(dá)顯著水平（P<0.05）[10]。本試驗結(jié)果表明，提高日糧能量水平對海南豬試驗?zāi)┵|(zhì)量、采食量的影響雖不顯著，但可顯著提高海南豬的平均日增質(zhì)量，并降低料肉比（P<0.05），這與劉秋在豪豬上的研究結(jié)果相一致。

營養(yǎng)物質(zhì)可通過各種途徑對基因表達(dá)進(jìn)行多層次、多水平的調(diào)控，從而影響動物機(jī)體的生長發(fā)育和物質(zhì)代謝。關(guān)于能量水平對IGFBP6基因表達(dá)量的影響尚未見報道。Towle等研究發(fā)現(xiàn)，日糧中的主要營養(yǎng)物質(zhì)可顯著影響動物體內(nèi)許多基因的表達(dá)，其中包括一些控制機(jī)體代謝關(guān)鍵酶的基因，從而影響機(jī)體的代謝過程[11-12]。Marinaro等研究發(fā)現(xiàn)，由IGFBP6基因引起的細(xì)胞間相互作用似乎受碳水化合物的抑制[13]。Osgerby等在對馬的研究中發(fā)現(xiàn)，不同營養(yǎng)水平會影響胎兒的大小，并隨IGFBPs的濃度而改變，營養(yǎng)水平越低則母體的IGFBP6基因mRNA越低（妊娠45～90 d），隨后開始上升，可見IGFBP6基因的水平受營養(yǎng)水平的影響，且其表達(dá)量具有時空效應(yīng)[14]。本研究中營養(yǎng)水平對IGFBP6基因表達(dá)量有一定的影響，即低能量水平的飼糧可使IGFBP6基因表達(dá)量升高，但與高能量組差異不顯著?？赡艿脑驗楦?、低營養(yǎng)水平之間差別不大，尚未達(dá)到顯著調(diào)控IGFBP6基因表達(dá)量的程度；雖然能量水平可影響IGFBP6基因的表達(dá)，但未必是調(diào)控IGFBP6基因表達(dá)量的最佳途徑。

Mei所構(gòu)建的IGFBP6基因敲除小鼠在生長、繁殖性狀上與野生小鼠沒有顯著差異[15]。Bienvenu等研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)人源IGFBP6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠質(zhì)量減輕，雌性小鼠生育能力顯著下降；過表達(dá)IGFBP6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠十二指腸質(zhì)量顯著減輕，其他器官與對照組無顯著差異[16]。上述研究并不能完全證明IGFBP6基因?qū)π∈笊L和繁殖的作用，IGFBPs家族蛋白代謝過程中的一系列代償作用也可能導(dǎo)致敲除小鼠與野生小鼠在表型上無顯著差異。萬斯妮對豬IGFBP6基因第4外顯子Taal-RFLP（T-C）位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該基因第4外顯子突變位點(diǎn)與豬胸腰椎膘厚、肌肉失水率、促甲狀腺素的含量均顯著相關(guān)（P<0.05）[5]。王文君采用PCR-SSCP技術(shù)在IGFBP6、G3079A、T4069G處檢測到2個SNP，相關(guān)性分析表明，AT單體型豬的生長發(fā)育性狀、產(chǎn)肉性狀均高于GG單體型豬，而板油質(zhì)量的指標(biāo)卻恰恰相反，可見 IGFBP6 基因是豬生長發(fā)育性狀的一個候選基因[6]。

IGFBP6基因是IGFs超家族中的一員，其細(xì)胞層面的研究表明，IGFBP6基因通過與IGF2結(jié)合阻斷其與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而可抑制由IGF2所介導(dǎo)的生長、發(fā)育、細(xì)胞粘連等[17]。Zhao等指出IGFBP6基因在胚胎時期的肌肉組織中表達(dá)量較高，可能與肌肉的分化有關(guān)[18]。虞德兵研究發(fā)現(xiàn)IGFIⅡ在豬肌肉組織中的表達(dá)水平隨日齡的增加呈下降趨勢[19]。房希碧等研究發(fā)現(xiàn)，豬肌肉組織中IGFBP6基因的表達(dá)量隨月齡的增加呈上升趨勢，可見肌肉組織中的IGFBP6基因可能通過依賴IGF的途徑發(fā)揮對生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用，但此調(diào)節(jié)作用并非影響豬體型大小的關(guān)鍵因素[7]。上述研究進(jìn)一步揭示了IGFBP6基因?qū)游锷L、繁殖的作用，以及IGFBP6基因表達(dá)量對動物生長發(fā)育性狀的影響。

本試驗首次研究了IGFBP6基因相對表達(dá)量與肥育豬生產(chǎn)性能的關(guān)系，結(jié)果表明IGFBP6基因表達(dá)量與料肉比呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與平均日增質(zhì)量、平均日采食量均呈不顯著正相關(guān)（P>0.05）。

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